光聚合诱导相分离构建细胞引导型微孔水凝胶支架及其在三维组织工程中的应用

针对传统多孔水凝胶无法实现原位时空可控成孔的难题，苏黎世联邦理工学院团队开发了基于光聚合诱导相分离(PIPS)的细胞引导型微孔水凝胶。该技术通过nPVA与硫酸葡聚糖(DS)的光触发相分离，可在秒级时间内形成2-40μm可调孔径，支持>95%细胞存活率并显著促进间充质干细胞(hMSCs)的成骨分化和胶原分泌，为复杂组织工程提供了新型支架材料。

　　

在组织工程领域，构建具有理想孔径和连通性的三维支架材料一直是重大挑战。传统方法如致孔剂浸出、微球退火等技术存在工艺复杂、耗时长的缺陷，且难以实现细胞封装过程中的原位孔隙调控。更关键的是，现有技术形成的纳米级孔隙（5-100nm）严重限制了细胞迁移和物质传输，导致组织再生效率低下。这些瓶颈问题严重制约了功能性组织构建的发展。

苏黎世联邦理工学院的研究团队在《Nature Communications》发表创新成果，开发出通过光聚合诱导相分离(PIPS)制备细胞引导型微孔水凝胶的新策略。该研究采用硫醇-烯光点击化学体系，将降冰片烯功能化聚乙烯醇(nPVA)与硫酸葡聚糖(DS)在水溶液中混合，在光引发剂(LAP)作用下实现秒级相分离，形成具有可调孔径(2-40μm)的互连多孔结构。研究通过相图构建、光流变分析和三维孔隙量化等系统表征，证实该材料能支持人源间充质干细胞(hMSCs)的高效三维培养和成骨分化，并成功整合体积打印技术实现复杂结构快速制造。

关键技术方法包括：1）光流变实时监测相分离动力学；2）快速傅里叶变换(RIFFT)量化孔隙特征；3）人原代间充质干细胞(hMSCs)和真皮成纤维细胞(HDFs)的三维封装实验；4）体积生物打印技术构建厘米级多孔支架。

【设计PIPS树脂的考虑因素】研究团队设计的光响应树脂包含nPVA（54kDa，功能化度3.5%）、DS（40kDa）、PEG-2-SH交联剂和LAP光引发剂。相图分析显示，当nPVA和DS浓度在2-3.5%范围时，体系处于临界点附近，光交联后形成体积相近的双连续相。光流变数据显示，交联30秒内储能模量(G')急剧上升，证实快速凝胶化过程。

【PIPS的证据】通过共聚焦显微镜观察到，交联前透明的树脂在紫外光照射后形成明显相分离结构。FITC-葡聚糖(500kDa)渗透实验证实孔隙的互连性。有趣的是，带电的DS比中性葡聚糖更易诱导相分离，RIFFT分析显示特征孔径为5μm，而中性对照组无孔隙形成。

【材料组成对结构和物理性能的影响】系统筛选发现3%nPVA+3%DS组合形成最大孔径（15μm）。流变测试显示，添加2.5%DS的样品刚度(111.4±5.0Pa)显著高于无DS对照组(62.5±2.0Pa)，表明相分离过程可能促进局部交联密度增加。浊度实验证实接近临界点的组成具有最大光散射强度。

【光强度对PIPS的影响】通过调节光强(5-100mW/cm²)，可实现孔径从8μm到2μm的精确调控。建立的理论模型表明，孔径(?)与光强(I)满足?～I^-1/3关系，这是由于较高光强加速交联，缩短了相分离域的生长时间。

【hMSCs的三维成骨培养】RGD功能化的PIPS水凝胶封装hMSCs（4×10⁶ cells/mL）显示，7天后细胞存活率>98%，显著高于对照组。FITC-葡聚糖示踪显示，细胞树突能在24小时内快速延伸至孔隙。28天培养后，PIPS组的骨钙素表达、碱性磷酸酶(ALP)活性和羟基磷灰石沉积量均显著提升，矿化面积是对照组的2倍以上。

【人成纤维细胞的三维培养】在PIPS水凝胶中，HDFs在12小时内即呈现显著铺展，而对照组仅轻微伸展。加入大分子拥挤剂(DS)后，胶原I分泌量进一步提升，显示孔隙结构与生化刺激的协同效应。

【体积打印优化】通过添加5%明胶提升树脂粘度，成功实现血管分支结构的体积打印（12秒完成）。打印体在37℃释放明胶后，FITC-葡聚糖渗透证实其保持18μm特征孔径的互连多孔结构。

该研究突破性地将光触发相分离与细胞封装相结合，创建了具有时空可控孔隙的支架平台。相比传统技术，PIPS水凝胶具有三大优势：1）nPVA提供>30个可点击烯烃位点，便于生物活性修饰；2）避免透明质酸体系的高剪切应力风险；3）秒级成型适合临床转化。研究证实微孔结构不仅能维持细胞高活力，还显著促进细胞三维形态发生和组织特异性分化。通过与体积打印技术的整合，该平台为复杂组织构建提供了新范式，在骨再生、皮肤工程等领域具有广阔应用前景。未来通过引入蛋白酶敏感基团，可进一步优化支架的降解性能，促进原位组织再生。