细菌转录终止因子Rho作为RNA:DNA杂合体解旋酶在体内的功能机制研究

研究人员针对细菌中RNA:DNA杂合体(RDH)的清除机制这一关键问题，开展了关于转录终止因子Rho作为RNA解旋酶的功能研究。通过遗传学、生物化学和细胞生物学方法，发现Rho PBS突变体在RNase HI缺失时表现出合成致死效应，证实Rho通过其解旋酶活性以rut位点依赖方式清除有害RDH结构。该研究揭示了Rho在RNase HI缺失条件下维持基因组稳定的新机制，为理解细菌RDH清除的分子机制提供了重要见解。

　　

在细菌细胞中，RNA:DNA杂合体(RDH)的形成是转录和复制过程中的常见现象，这些结构若不能及时清除将导致严重的基因组不稳定。虽然核糖核酸酶HI(RNase HI)是清除RDH的主要酶类，但令人困惑的是，RNase HI缺失的细菌仍能存活，暗示存在其他清除机制。这一科学谜题引起了研究人员的浓厚兴趣。

中国科学院的研究团队将目光投向了细菌转录终止因子Rho。这个六聚体蛋白此前已被证明在体外具有RNA解旋酶活性，能够解开RDH结构。但它在体内的这一功能是否具有生理意义？与RNase HI是否存在功能互补？这些问题成为研究的核心。

研究采用了多种前沿技术方法：通过构建rho和rnh基因的系列突变体进行遗传互补分析；利用免疫印迹和超分辨率显微镜技术检测RDH积累；开发了mCherry标记的Rho蛋白进行共定位研究；建立体外荧光标记的RDH解旋实验系统。

研究结果部分首先验证了关键假设。合成生长缺陷实验显示，Rho PBS结构域突变体(Y80C和P103L)在RNase HI缺失时表现出合成致死效应，而在RNase HII缺失时则无此现象。这表明Rho特异性补偿RNase HI而非RNase HII的功能。生理表型分析部分发现，rho Y80C/rnhA^-菌株表现出典型的RNase HI缺失表型：对UV和丝裂霉素C高度敏感、ColE1质粒多聚体增加、细胞形态异常延长。这些结果强烈暗示Rho参与RDH清除过程。

RDH积累检测部分提供了直接证据。免疫印迹显示rho Y80C/rnhA^-菌株中RDH水平比野生型高4.5倍。超分辨率显微镜结合泊松分布统计证实，该菌株每个细胞的RDH焦点数显著增加(λ从0.17升至23.25)。这些数据表明Rho功能缺陷导致RDH清除障碍。

共定位研究部分揭示了Rho的作用机制。通过mCherry-Rho与S9.6抗体的双标记，发现RNase HI缺失时，Rho与RDH的共定位比例从14%升至72%。Pearson相关系数分析显示两者信号呈显著正相关(PCC=0.221)。特别有趣的是，当表达能结合但不切割RDH的RNase HI突变体(D10N和D70N)时，Rho对RDH的访问被阻断，导致细胞死亡。这为Rho直接参与RDH清除提供了有力证据。

体外实验部分阐明了分子机制。荧光标记的RDH解旋实验证明，Rho以rut位点依赖的方式解开RDH结构。当用反义寡核苷酸封闭rut位点或加入D70N RNase HI时，Rho的解旋活性被抑制。凝胶迁移实验还发现Rho能直接结合RDH形成二元复合物。

在讨论部分，作者提出了创新性观点：Rho可能主要作为RNA解旋酶而非转录终止因子发挥作用。超分辨率显微镜显示大多数Rho分子分布在细胞膜附近，而非与转录机器共定位。这暗示膜定位的Rho可能参与核糖体组装或RNA降解体相关的RNA重塑过程。研究还发现Rho与RNase HI在RDH清除中存在功能协同，当RNase HI失效时，Rho的解旋酶活性成为维持基因组稳定的关键备份机制。

该研究的重要意义在于：首次在体内证实了Rho作为RNA解旋酶清除RDH的生理功能；阐明了细菌应对RDH积累的备份机制；为理解RNA解旋酶在基因组稳定性维持中的作用提供了新视角。这些发现不仅拓展了对Rho蛋白多功能性的认识，也为开发针对RDH相关疾病的新策略提供了理论依据。论文发表在《Biochemical Journal》上，为细菌转录调控和基因组稳定性领域做出了重要贡献。