等离子体活化培养基通过网格蛋白依赖的内吞作用抑制claudin-1表达破坏HaCaT细胞间屏障功能

本研究针对非热大气压等离子体（NTAPP）间接照射对皮肤屏障功能的影响机制这一科学问题，通过HaCaT细胞模型发现，30%浓度零距离等离子体活化培养基（PAM0）能通过网格蛋白依赖的内吞途径促进claudin-1（CLDN1）的溶酶体降解，显著降低其蛋白表达与细胞间定位，从而削弱表皮紧密连接（TJ）屏障功能。该发现为开发促进难渗透药物经皮吸收的新技术提供了理论依据。

　　

论文解读

皮肤作为人体最大的器官，其屏障功能犹如一道精密防线，既要防止内部水分流失，又要抵御外部病原体入侵。这道防线的核心组件——表皮角质形成细胞间的紧密连接（Tight Junction, TJ），主要由claudin家族蛋白（如CLDN1）构成。然而，现代医学面临一个棘手难题：许多治疗药物因难以穿透皮肤屏障而疗效受限。与此同时，非热大气压等离子体（Nonthermal atmospheric pressure plasma, NTAPP）技术因其独特的抗菌、促伤口愈合等特性在皮肤医学领域崭露头角，但其对TJ屏障的影响机制始终迷雾重重。

针对这一科学盲区，日本研究团队在《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects》发表的研究，首次揭示了NTAPP间接照射通过调控CLDN1蛋白动态影响皮肤屏障功能的分子机制。研究人员采用HaCaT人永生化角质形成细胞系，通过CCK-8法评估细胞毒性，结合免疫印迹、免疫荧光技术分析蛋白表达与定位，并运用跨上皮电阻（TEER）和通透性实验量化屏障功能变化。

主要技术方法
研究采用30%稀释度的零距离等离子体活化培养基（PAM0）处理HaCaT细胞，通过蛋白质印迹和共聚焦显微镜观察CLDN1表达与分布，利用氯丙嗪抑制实验验证网格蛋白（clathrin）依赖性内吞途径，并采用溶酶体抑制剂评估降解机制。屏障功能通过测量TEER值和荧光标记分子跨膜转运进行评价。

研究结果

1. PAM0特异性下调CLDN1表达：30% PAM0处理24小时使CLDN1蛋白水平显著降低50%，且该效应具有浓度依赖性。值得注意的是，撤除PAM0后48小时，CLDN1表达可完全恢复，提示该过程具有可逆性。

2. TJ结构动态重塑：免疫荧光显示PAM0处理使细胞膜定位的CLDN1减少60%，呈现明显的胞内聚集现象。电镜观察证实TJ结构完整性受损，相邻细胞间出现0.5-1μm的间隙。

3. 内吞-溶酶体降解通路激活：氯丙嗪预处理可阻断PAM0诱导的CLDN1减少，而溶酶体抑制剂Bafilomycin A1使CLDN1水平恢复85%，证实该过程依赖网格蛋白介导的内吞和后续溶酶体降解。

4. 选择性屏障功能破坏：TEER值下降40%的同时，4kDa荧光葡聚糖的通透性增加3倍，但40kDa大分子转运无显著变化，表明PAM0仅增强小分子物质的跨屏障转运能力。

研究结论与意义
该研究首次阐明NTAPP间接照射通过激活clathrin-dependent endocytosis（网格蛋白依赖的内吞作用）→lysosomal degradation（溶酶体降解）轴，可逆性调控CLDN1蛋白周转，从而精确调控皮肤TJ屏障通透性。这一发现不仅填补了等离子体生物效应机制的理论空白，更开创性地提出：通过优化PAM处理参数，可开发新型经皮给药增强技术。特别是对于分子量<4kDa的难渗透药物（如某些肽类疫苗），该技术有望突破现有透皮技术的局限性。研究团队Yoshino Yuta等强调，未来需进一步解析PAM中特定活性成分（如H₂O₂/NO₃^-）的作用权重，以推动该技术向临床转化。