AAVone单质粒系统：高效降低DNA杂质的新型AAV生产平台

【编辑推荐】本研究创新性开发了AAVone单质粒系统，将腺病毒辅助基因(E2A/E4orf6/VA RNA)、AAV包装基因(rep/cap)及转基因表达盒整合至13-kb骨架的单一质粒。相比传统三质粒系统，产量提升2-4倍，批次差异降低，且显著减少质粒骨架DNA杂质(<1%)和反向回折基因组(snap-back genomes)，同时维持理想的完整:空壳颗粒比(full:empty ratio)，为GMP级AAV生产提供高效经济的新方案。

　　

【AAVone单质粒系统的创新设计与验证】
研究团队通过将腺病毒辅助基因(E2A/E4orf6/VA RNA)、AAV包装基因(rep/cap)和转基因表达盒整合至13-kb骨架的单一质粒，构建了AAVone系统。该系统通过删除E2A和E4orf6基因内含子，将辅助质粒从11.6 kb精简至8.4 kb（mini-pHelper-1.0），并优化元件排列顺序——将转基因表达盒置于细菌骨架与VA RNA之间，rep-cap置于VA RNA与E4orf6之间。这种设计使15.8-kb的pAAVone质粒在HEK-293T悬浮细胞中实现1.53×10¹⁵ vg/L的粗滴度，较传统三质粒系统提升4倍。

【高效生产的核心优势】
AAVone系统在悬浮培养中仅需0.25-0.50 μg质粒/10⁶细胞，较三质粒系统减少75% DNA用量。通过PEImax转染时，AAV9载体在3×10⁶ cells/mL密度下获得3.7×10¹⁵ vg/L粗滴度，经CsCl超速离心纯化后达1.03×10¹⁵ vg/L。分析超速离心(AUC)显示，降低质粒用量可使完整颗粒比例从30.02%提升至38.48%。该系统兼容AAV1/2/8/9/rh.10/PHP.eB等多种血清型，4.7-kb大基因组仍能维持1.94×10¹⁵ vg/L产量。

【载体质量的全面评估】
电泳与质谱分析证实，AAVone生产的载体VP1/VP2/VP3蛋白比例保持1:1:10，与三质粒系统无差异。单分子实时测序(SMRT)显示58.77%基因组为完整2,770 nt序列（含修复的145 nt ITR），snap-back基因组减少50%。ITR分析表明，C臂缺失的ITR仅占1.5%，且flip/flop构型比例平衡。视网膜注射实验证实，AAV2载体在1×10⁹ vg/眼剂量下，56%-59%光感受器外节呈现EGFP阳性，与对照组相当。

【杂质谱的显著改善】
qPCR检测发现AAVone系统将细菌骨架杂质从3.95%降至0.87%，但VA RNA序列占比升至2.35%。宿主基因组(hcDNA)污染维持在3%，且80%片段短于1,140 nt（小于最小致癌基因1,664 nt）。rcAAV检测显示，虽存在0.045%的ITR-rep-cap嵌合序列，但均未形成完整复制元件，符合FDA每10⁸载体基因组≤1 rcAAV的标准。

【临床应用潜力与机制探讨】
该系统通过共定位所有元件于单一质粒，确保每个转染细胞均含完整生产组件，使有效生产率提升4-5倍。在肌肉和脑部递送实验中，AAV8（胫前肌注射）和AAV-PHP.eB（静脉注射）均显示与三质粒系统相当的转导效率。研究者推测，降低质粒用量可减轻Rep蛋白和PEI的细胞毒性，同时平衡Cap表达与基因组复制，从而优化完整颗粒比例。

【技术突破与行业价值】
作为首个单质粒AAV生产系统，AAVone解决了三质粒系统需优化比例（通常pHelper:pRCap:pAAV=1:1:1）、批次差异大等问题。其13-kb骨架设计通过增大ITR间距，有效抑制反向包装。该技术已实现从Ambr 250到XDR200生物反应器的规模放大，为基因治疗提供符合GMP要求的高纯度、高产率解决方案。