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该综述聚焦功能性聚（2 - 噁唑啉）（POx）交联剂构建的冷冻凝胶，探讨不同聚合端基、侧链官能团（乙基、活性胺或酯基）及引入 N,N - 二甲基丙烯酰胺（DMAAm）共聚单体对凝胶结构与性能的影响，涉及表征手段、力学 / 溶胀特性及 pH 响应性等。
摘要
本研究展示了利用功能性聚（2 - 噁唑啉）（POx）交联剂合成一系列冷冻凝胶的过程。这些交联剂在可聚合端基的数量和类型以及侧链中存在的官能团（乙基、活性胺或酯基）方面存在差异。所有冷冻凝胶均仅基于相应的交联剂制备，部分还通过添加 N,N - 二甲基丙烯酰胺（DMAAm）作为共聚单体来制备。通过固态核磁共振（ssNMR）验证了凝胶的化学结构。分别采用扫描电子显微镜（SEM）和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）检查干燥和水合凝胶的多孔结构。热重分析（TGA）表明所有凝胶都能承受高压灭菌过程，这对潜在的细胞分析很重要。力学和溶胀性能对所用交联剂（CL）有明显依赖性。DMAAm 作为共聚单体的加入使调节所得冷冻凝胶的刚度成为可能。由于储能模量在 200 至 4000 Pa 范围内，所获得的冷冻凝胶可作为模拟软组织特性（如乳房、肺、胰腺、肾脏或大脑中的组织特性）的模型。进行的 pH 依赖性溶胀测试提供了所选凝胶的刺激响应行为，含双功能胺的冷冻凝胶表现出最显著的响应。
引言
冷冻凝胶是由水性单体溶液制备的三维聚合物结构。通过冷冻这种溶液，形成冰晶，导致单体溶液保持未冻结状态并集中在冰晶周围。聚合在冰晶周围发生，解冻去除冰晶后，留下具有相互连接孔的聚合物网络。由于这种海绵状微结构，冷冻凝胶被用作生物反应器、用于重金属吸附、作为分离系统，在组织工程或生物医学应用中也有应用。特别是在生物分离中，它们显示出巨大潜力，例如分离酶。冷冻凝胶的特殊性质还可用于药物递送应用，前提是具有足够的机械稳定性和弹性，以防止凝胶变形和容易破裂。药物释放可以通过扩散、溶胀、侵蚀或施加到凝胶上的某些物理刺激来控制。
在组织工程领域，调节凝胶机械性能的可能性将是有益的。研究表明，刚度对各种细胞过程有显著影响，包括粘附、形状和干细胞分化。在水凝胶的具体情况下，已证明凝胶的机械特性直接影响干细胞的增殖和分化。到目前为止，此类实验仅在水凝胶上进行，而未在冷冻凝胶上进行。由于冷冻凝胶具有明显更大的相互连接的孔系统，可用于供应营养或去除废物产物，并且与水凝胶相比具有优异的机械稳定性，因此未来可考虑将其用于此类细胞实验。因此，有可能设计出能够模拟软和硬生物组织（如肺或乳房、肌肉或骨骼中的组织）的组织。
材料性能的调节可通过选择用于冷冻凝胶制备的交联剂（CL）及其用量和交联点之间的链长来实现。例如，与多功能交联剂相比，双功能交联剂能够制备更软的结构，这可归因于交联密度的差异。使用某些共聚单体如 N,N - 二甲基丙烯酰胺（DMAAm）或丙烯酰胺（AAm），可以进一步调节机械性能。除了机械性能外，冷冻凝胶的溶胀行为对于模拟生物组织的含水量特别重要。此外，由于溶胀或去溶胀时孔径的变化，从冷冻凝胶中释放药物的速度可以加快或减慢。调节溶胀行为的潜力近年来一直是人们关注的主题。例如，含有胺、硫酸盐或羧酸基团的冷冻凝胶表现出 pH 响应性溶胀行为。此外，其他刺激，包括氧化还原条件、光或温度，可用于通过外部刺激影响凝胶的性质，例如模拟细胞外基质的降解。
交联剂，如聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）或聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEGDMA），通常用于制备生物应用的冷冻凝胶。聚（2 - 噁唑啉）（POx）是一类有趣的聚合物，兼具水溶性和优异的生物相容性（如果使用具有甲基或乙基侧链的 2 - 噁唑啉），同时还能实现一定的结构多样性。通过阳离子开环聚合（CROP）制备，使用不同的 CROP 引发剂可产生单、双、三甚至多功能的 POx，导致相应冷冻凝胶中交联点密度的变化。通过使用合适的 CROP 终止剂如丙烯酸、甲基丙烯酸或哌嗪 - 丙烯酰胺直接引入可聚合的 ω- 端基，能够制备含有例如 pH 可降解酯基或 pH 稳定酰胺基的冷冻凝胶。此外，通过 2 - 乙基 - 2 - 噁唑啉（EtOx）与功能性 2 - 噁唑啉如叔丁基（3-（4,5 - 二氢噁唑 - 2 - 基）丙基）氨基甲酸酯（BocOx）或甲基 3-（4,5 - 二氢噁唑 - 2 - 基）丙酸酯（MestOx）的共聚，可以在相应的聚合物中引入不同的侧链官能团。P (MestOx) 中活性酯基的存在使其有可能通过直接酰胺化用于偶联过程。在 BocOx 的情况下，氨基可以脱保护以在侧链中形成伯胺（AmOx）。这些胺也可用于所需的偶联反应。到目前为止，文献中仅已知基于 EtOx 的冷冻凝胶。在基于 POx 的交联剂的侧链中使用胺或活性酯在冷冻凝胶生产中的应用以前尚未有文献记载。它有可能促进聚合后过程中的后续功能化。
在这项工作中，我们介绍了仅基于功能性聚（2 - 噁唑啉）交联剂或通过添加 DMAAm 作为共聚单体来制备功能性冷冻凝胶。本研究的目的是更好地理解结构特征与物理性质（包括溶胀、热性质、机械性质和 pH 响应性）之间的相关性。此前，我们描述了基于 EtOx 的冷冻凝胶的制备，在本出版物中作为比较，并额外测试了它们的机械性能。
材料与方法
化学试剂按原样从 Sigma-Aldrich 购买：N,N,N’,N’- 四甲基乙二胺（TMEDA，99%）和 N,N’- 二甲基丙烯酰胺（DMAAm，99%）。过硫酸钾（K?S?O?，≥98%，Fluka Analytical）、丙烯酰氧乙基硫代氨基甲酰罗丹明 B（RhoB，≤100%，Polysciences）和 PBS 缓冲液（Capricorn Scientific）按原样使用。所有其他化学试剂和溶剂均从常见商业来源获得，除非另有说明，否则无需进一步纯化即可使用。
13C 固态核磁共振（13C ssNMR）谱在 400 MHz Bruker Avance III HD 光谱仪上于室温下使用 4 mm MAS 样品头记录。
使用带有 SE-2 检测器和 10 kV 加速电压的 Zeiss Sigma VP 场发射扫描电子显微镜（德国耶拿）获得用于形态研究的冷冻凝胶的扫描电子显微镜（SEM）显微照片。为此，将干燥的冷冻凝胶切片用 CCU-010 HV Safematic 溅射涂层机（瑞士齐泽斯）涂覆 9 nm 铂层，并使用导电碳粘合剂垫固定在板夹销上。在拍摄选定的高放大倍数视图之前，先获得整个样品的全视图图片。
使用共聚焦激光扫描显微镜 LSM880 Elyra PS.1 系统（德国蔡司，奥伯科亨）和 C-Apochromat 40×/1.2 W Korr FCS M27 物镜对水合冷冻凝胶进行显微镜评估。用 514 激光激发罗丹明 B 标记的冷冻凝胶，并使用 ZEN 软件采集和分析图像。
热重分析（TGA）在氮气气氛下使用 Netzsch TG209 F1 Libra（德国塞尔布）进行。对于测量，使用标准方法如下：从 25 到 600°C 连续加热，加热速率为 20 K min?1；时间：29 分钟）。如有必要，测量后使用 Netzsch Proteus 热分析软件 8.0.2 版对数据进行平滑处理。
流变学测量在 Anton Paar（奥地利格拉茨）的 MCR 301 流变仪上使用对流烤箱装置 CTD 450 进行。使用一次性平板（D-PP15，Anton Paar（奥地利格拉茨））或锥角 α=1° 的锥板测量装置（D-CP15，Anton Paar（奥地利格拉茨））测量样品。样品间隙设置在 0.8 至 4.8 mm 之间。使用 RheoCompassTM V1.30.1064-Release 64-bit 软件（Anton Paar，格拉茨，奥地利）操作流变仪并进行分析。数据导出为 txt 文件，并使用 OriginPro 2022b（OriginLab Corporation，北安普顿，马萨诸塞州，美国）进行评估和处理。
冷冻凝胶的干燥通过使用 Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH（德国）的 Alpha 2–4 LD plus 冷冻干燥机进行。
除非另有说明，否则所有冷冻凝胶制备均使用来自 Merck Millipore 水净化系统的超纯水。为了精确和可调地控制冷冻聚合反应的反应温度，使用了 Julabo GmbH（德国塞尔巴赫）的 FP40-MC 低温恒温器。
如前所述，使用 5 mL 聚丙烯注射器作为反应容器一式两份地进行冷冻凝胶制备。简而言之，制备含有 0.2 mol% 丙烯酰氧乙基硫代氨基甲酰罗丹明 B（RhoB）、交联剂、N,N’- 二甲基丙烯酰胺（如果使用的话作为共聚单体）和 K?S?O?的水性单体溶液，然后在超声浴中均质化。然后将溶液在 0°C 下用氩气吹扫 30 分钟，然后吸入注射器中。随后，通过底端加入水性 N,N,N’,N’- 四甲基乙二胺溶液（80 μL 的 1.114 M 溶液，0.089 mmol），然后使用注射器塞子进行底端封盖并涡旋 10 秒。对于冷冻聚合，将封盖的注射器放置在低温恒温器冷却浴（–12°C）中过夜，使用带孔聚苯乙烯网格。从低温恒温器浴中取出并在室温下解冻 1 小时后，将所得冷冻凝胶浸入水中，随后换水 5 天。将切割的冷冻凝胶切片冷冻干燥至少 2 天。将三或四片研磨成细粉用于 ssNMR 和热重分析。确切的实验细节总结在表 S1-S3 中。
流变学测量按照文献程序进行。储能模量 G’通过在 25°C 下在 0.03 至 1.0 Hz 的频率范围内以 0.005% 的振荡剪切变形进行的频率扫描来确定。所有冷冻凝胶在蒸馏水中溶胀过夜，然后转移到流变仪中。为了防止冷冻凝胶在测量过程中干燥，样品周围用蒸馏水包围。由于样品的残留不均匀性导致值指示其为异常值，因此始终忽略第一个测量点。
冷冻凝胶的溶胀行为如文献所述在室温下通过在含有去离子水的小瓶中取样干燥冷冻凝胶的圆形片（n=3）来研究。在周期性时间点（20 s、40 s、60 s、300 s、1800 s），在除去粘附在表面的过量水后，记录冷冻凝胶样品的质量增加。此外，对 CG (B-Mest-PipA/DMAAm) 和 CG (T-Mest-PipA/DMAAm) 测量了 3600 s 的时间点。
水吸收量根据以下公式（1）计算为冷冻凝胶溶胀率：
CG swelling ratio=m(CG)drym(CG)wet?m(CG)dry
其中 m (CG) wet 和 m (CG) dry 分别对应于冷冻凝胶在溶胀和干燥状态下的质量。
仅对基于双功能和三功能均聚物 EtOx（CG (B-Et) 和 CG (T-Et)）或具有哌嗪 - 丙烯酰胺（PipA）端基的 AmOx 共聚物交联剂（B-Am 和 T-Am）以及与 DMAAm 作为共聚单体组合的冷冻凝胶样品进行 pH 依赖性溶胀测试。将每片分别置于 0.1 M 乙酸溶液（pH=3）、PBS 缓冲液或 1 M NaOH 水溶液（pH=14）中溶胀。在溶胀过程之前和之后获得摄影记录。此外，如前所述确定最大溶胀度。
结论
在本文提出的工作中，建立了基于具有修饰侧链和端基的双功能和三功能聚（2 - 噁唑啉）交联剂的功能性冷冻凝胶，并对其结构 - 性能行为进行了表征。我们成功地从所有使用的交联剂中获得了稳定的冷冻凝胶，无论是否添加 DMAAm 作为共聚单体。ssNMR 分析表明，如果存在，相应的交联剂和 DMAAm 共聚单体已成功掺入。扫描电子显微镜...（此处因原文结论部分内容不完整，仅按现有内容总结）
