蟋蟀瘫痪病毒内部核糖体进入位点序列 - 功能关系的全面突变分析

【编辑推荐】为解析病毒内部核糖体进入位点（IRES）序列与功能关系，耶鲁大学研究团队利用 SMARTI 技术对蟋蟀瘫痪病毒（CrPV）IRES 的超 8.1 万个单 / 双突变体进行分析，发现其假结结构中存在可修饰位点，且突变可能通过假易位增强功能，为 IRES 机制研究及生物工程应用奠定基础。

　　

在生命科学领域，病毒如何突破宿主防线进行蛋白质翻译一直是备受关注的谜题。内部核糖体进入位点（IRES）作为病毒 RNA 的关键元件，能在缺乏宿主起始因子的情况下招募核糖体，这一特性使其成为研究翻译机制和开发蛋白表达工具的核心对象。以蟋蟀瘫痪病毒（CrPV）为代表的 IRES 因其长度短、机制简单且能在多种无细胞系统中发挥作用，成为理想的研究模型。然而，这类 IRES 的序列 - 功能关系尚未完全解析，尤其是其假结结构（pseudoknot）在翻译起始中的具体作用、单个核苷酸突变如何影响功能等问题，限制了其在合成生物学和生物工程中的应用潜力。

为攻克这些难题，美国耶鲁大学（Yale University）的 Sabrina G. Grunseich 和 Scott A. Strobel 团队开展了一项系统性研究。他们利用基于 RelE 核酸酶的高通量测序方法 SMARTI（sequencing-based mutational analysis of RNA translation initiation），对 CrPV IRES 的 81000 多个单突变和双突变体进行了功能定量分析，相关成果发表在《Nucleic Acids Research》上。这项研究不仅构建了首个全面的 CrPV IRES 突变数据库，还揭示了其结构动态与功能平衡的关键机制，为理解同类病毒 IRES 及优化生物工具提供了新视角。

研究团队主要采用了以下关键技术方法：

1. 突变文库构建：设计包含 CrPV IRES 全序列（核苷酸 6029–6216）的单突变文库，以及聚焦核糖体结合域和假结 I（PKI）的双突变文库，通过掺杂寡核苷酸实现突变频率控制。
2. SMARTI 技术：利用 RelE 核酸酶特异性切割核糖体 A 位点结合的 mRNA，通过高通量测序和数据分析，定量评估突变体的核糖体结合效率和假易位动力学。
3. 双荧光素酶报告系统：在小麦胚芽提取物和兔网织红细胞裂解液中验证突变体的蛋白质翻译能力，结合 RelE 切割数据综合分析功能变化。

研究结果

1. CrPV IRES 的翻译起始机制与 RelE 切割验证

CrPV IRES 通过假结 II（PKII）和假结 III（PKIII）结合核糖体 40S 亚基，其 tRNA 模拟结构域（假结 I，PKI）占据 A 位点，需经 eEF2 介导的假易位（pseudotranslocation）将首个可翻译密码子移至 A 位点。RelE 切割实验表明，野生型 IRES 在小麦胚芽提取物中可被有效切割（振幅 55%），而破坏 PKI 的突变体（如 CC_6214-6215GG）完全丧失切割能力，证实 RelE 切割可作为核糖体结合和假易位成功的标志。

2. 高通量突变分析揭示关键功能区域

SMARTI 数据显示，单突变体的切割振幅范围为 0%–50%，双突变体中 8% 完全失活，45% 表现出可检测功能。假结结构的突变效应呈现显著异质性：

• 假结 I（PKI）：其螺旋区 P3.1 的 U₆₁₇₉C、U₆₁₈₀C 等突变通过破坏碱基对增强灵活性，使振幅和速率常数提升超两倍；PKI 核心区 A₆₁₈₇G 突变形成 GU 摆动对，可促进核糖体结合，但反向突变则导致功能丧失。
• 假结 III（PKIII）：前两对碱基（U₆₁₀₁/A₆₁₃₇、A₆₁₀₂/U₆₁₃₆）可耐受突变，而后两对 GC 碱基（G₆₁₀₃/C₆₁₃₅、G₆₁₀₄/C₆₁₃₄）为结构必需，突变会导致功能丧失，提示 PKIII 的末端碱基对在进化中高度保守。
• 假结 II（PKII）：缩短螺旋长度或破坏碱基对（如 PKII_1、PKII_2 突变）虽可维持核糖体结合，但显著抑制蛋白质翻译，表明 PKII 在假易位后的 tRNA 递送或移位步骤中起关键作用。

3. 突变体功能与蛋白质翻译的关联性

双荧光素酶实验显示，PKI 和 P3.1 区的优化突变（如 A₆₁₈₇G、U₆₁₇₉C）仅轻微提升蛋白产量，而 PKIII 的部分突变（如 PKIII_1、PKIII_2）虽保留结合能力，但翻译效率显著下降。这表明 IRES 功能受多阶段调控，假易位效率并非唯一限速步骤，下游的 tRNA 递送和核糖体移位可能成为瓶颈。此外，PKII 突变体在 SMARTI 中表现出的 “结合增强但翻译缺陷” 现象，揭示了 IRES 结构稳定性与动态性的平衡需求 —— 过度破坏 PKII 可能干扰核糖体后续构象变化。

研究结论与意义

该研究通过大规模突变分析，首次建立了 CrPV IRES 的序列 - 功能全景图，证实其假结结构中存在可修饰位点，且适当突变可通过增强灵活性或假易位效率提升功能。关键发现包括：

1. 结构 - 功能平衡：IRES 需在稳定性（如 PKIII 末端 GC 碱基对）与动态性（如 P3.1 区柔性）之间维持平衡，以确保核糖体结合、假易位及后续翻译步骤的有序进行。
2. 工程化潜力：鉴定出的优化突变体（如 A₆₁₈₇G）为设计高效蛋白表达元件提供了靶点，而 SMARTI 技术在真核提取物中的兼容性，为研究其他复杂 RNA 元件（如哺乳动物 IRES）开辟了新路径。
3. 机制拓展：CrPV IRES 的 “动态假结” 模型为理解同类病毒（如双顺反子病毒科）的翻译策略提供了模板，尤其是其不依赖起始因子的独特机制，可能为抗病毒药物开发提供新方向。

这项研究不仅深化了对病毒翻译机制的认知，更通过高通量技术与功能验证的结合，为 RNA 元件的系统生物学研究树立了典范。未来，基于该数据库的进一步优化有望推动 IRES 在合成生物学、无细胞蛋白生产等领域的广泛应用。