基于Box-Behnken设计的高效液相色谱法同时测定阿来替尼及其杂质5-三氟乙酸盐的绿色分析方法开发与验证

本研究针对非小细胞肺癌(NSCLC)靶向药物阿来替尼(ALEC)及其杂质5-三氟乙酸盐(IMP5)缺乏同步检测方法的难题，开发了基于Box-Behnken设计(BBD)的绿色高效液相色谱(HPLC)分析方法。通过响应面法优化色谱条件，采用复合绿色分析程序指数(ComplexGAPI)和白度分析化学(WAC)工具评估方法可持续性，实现了0.1-0.3μg/mL的检测限(LOD)和0.3-0.5μg/mL的定量限(LOQ)，为药品质量控制提供了兼具高灵敏度和环境友好性的解决方案。

　　

肺癌是全球最常见且致死率最高的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌(NSCLC)占比高达84%。随着分子靶向治疗的发展，间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂阿来替尼(ALEC)成为治疗ALK重排NSCLC的重要药物。然而，药物中的杂质可能引发严重不良反应，目前尚无同步检测ALEC及其主要杂质5-三氟乙酸盐(IMP5)的分析方法。传统方法存在有机溶剂消耗大、分析时间长等问题，且缺乏对方法可持续性的系统评估。

为解决这些问题，Anadolu大学的研究人员开发了一种创新的高效液相色谱(HPLC)方法，相关成果发表在《BMC Chemistry》。研究采用Box-Behnken设计(BBD)优化色谱条件，建立梯度洗脱程序，使用Ascentis? Express 90 ? C₈色谱柱，以乙腈-乙酸铵缓冲液(pH 5.42)为流动相，在269 nm波长下实现ALEC和IMP5的基线分离。通过国际协调委员会(ICH)Q2(R2)指南验证方法性能，并首次将测量不确定度评估与白度、蓝度、绿度(White Analytical Chemistry)综合评价体系相结合。

关键技术包括：1)基于BBD的三因素三水平实验设计优化色谱参数；2)采用蒙特卡洛模拟评估测量不确定度；3)应用ComplexGAPI、AGREE和BAGI工具进行绿色评价；4)通过White Analytical Chemistry模型评估方法可持续性。

方法优化
通过BBD设计考察缓冲液浓度(5-15 mM)、流速(0.5-0.6 mL/min)和pH(4.5-6.5)对分离效果的影响。建立的二次多项式模型R²>0.99，预测ALEC和IMP5的容量因子(k')分别为2.79和1.26，分辨率(Rs)达15.35和11.81。优化条件为：15 mM乙酸铵缓冲液(pH 5.42)，流速0.55 mL/min，柱温40±1°C。

方法验证
验证结果显示：ALEC和IMP5的LOD分别为0.1和0.3μg/mL，LOQ为0.3和0.5μg/mL，满足ICH Q3B(R2)对每日600 mg剂量下杂质检测要求(≤0.2%)。线性范围0.5-15μg/mL内R²>0.999，回收率98.93-102.31%，RSD<2.18%。

测量不确定度
采用"自下而上"方法量化不确定度来源，蒙特卡洛模拟(n=100,000)显示结果呈正态分布。ALEC和IMP5的合成不确定度分别为1.0156和0.9427，扩展不确定度(k=2)满足药典要求。

可持续性评价
ComplexGAPI评估显示3/12红色指标(高风险)，AGREE得分为0.65(绿色)，BAGI可行性评分82.5(深蓝)。White Analytical Chemistry综合评价达83.8%，其中红色(效率)87.5%，绿色(环境影响)83.8%，蓝色(经济性)80.2%。

该研究首次建立了ALEC与IMP5的同步检测方法，解决了现有技术无法同时测定药物主成分与关键杂质的难题。通过BBD设计显著提升方法开发效率，较传统单变量优化减少60%实验次数。引入的测量不确定度评估体系为药品质量控制提供了更可靠的判定依据，而创新的白度-绿度综合评价模型为分析方法可持续发展树立了新标准。该方法已成功应用于Alecensa?胶囊(150 mg/粒)的质控分析，为ALK抑制剂的研发与生产提供了关键技术支撑。

研究团队Serkan Levent等提出的多维评价框架，将分析性能、环境友好性和经济可行性有机结合，代表了现代药物分析向"绿色精准分析"发展的新趋势。该方法不仅适用于常规质控实验室，其设计理念对生物样本分析方法的开发也具有重要借鉴意义。未来研究可进一步拓展该方法在治疗药物监测(TDM)和代谢产物分析中的应用。