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为解决碳水化合物疫苗生产中异源基因簇重组存在的抗生素依赖、遗传不稳定等问题，研究人员利用自杀载体介导的等位基因交换法，在大肠杆菌染色体水平插入异源多糖基因簇，实现无明显代谢负担的 LPS 生产，且抗原具免疫原性，为疫苗开发提供新平台。
在疫苗研发的广阔领域中，碳水化合物疫苗因其对公共卫生的显著影响而备受瞩目。这类疫苗的核心在于高效生产碳水化合物抗原，然而传统方法面临诸多挑战。一方面，通过表达质粒进行异源基因簇重组时，存在持续抗生素选择压力、遗传不稳定以及代谢负担等问题，限制了其大规模应用。另一方面，从致病细菌中提取抗原不仅成本高昂，还存在生物安全隐患，且受限于易于纯化的病原体种类，难以满足多样化的疾病防控需求。因此，开发一种更安全、高效且经济的生产方式成为迫切需要。
为突破这些瓶颈，西南大学的研究人员开展了针对非致病性大肠杆菌 K-12 的糖工程研究，相关成果发表在《Microbial Cell Factories》。他们致力于在染色体水平实现异源多糖基因簇的稳定表达，以规避质粒系统的固有缺陷，为碳水化合物抗原的生产提供新策略。
研究中采用的关键技术方法包括：自杀载体介导的等位基因交换法，该方法无需依赖 I-SceI 核酸内切酶、CRISPR/Cas 系统或 λ-red 重组酶，通过体外组装多个大 DNA 片段构建自杀质粒，结合蔗糖反选择和抗生素筛选，实现染色体上异源基因簇的无痕插入或仅留单个 FRT 疤痕；利用 Gibson 组装技术完成大 DNA 片段的体外拼接；通过全基因组测序验证插入正确性；运用银染色、Western blot、流式细胞术等评估多糖表型；借助小鼠免疫实验分析抗原免疫原性。
自杀载体构建与基因簇插入
研究人员以沙门氏菌属的 O 抗原基因簇（如 S. Typhimurium、S. Enteritidis、S. Paratyphi A 的 OAgST、OAgSE、OAgSA）及 S. Typhi 的 Vi 荚膜 viaB_locus 为目标，通过长距离 PCR 扩增基因簇，利用 Gibson 组装将其与自杀质粒 pRE112 backbone 结合，构建携带 15-20 kbp 异源基因簇的重组质粒。通过两次同源重组，将基因簇插入大肠杆菌 W3110 的 O 抗原位点，一种策略实现无痕插入（如替换为 viaB_locus 的 L0149 菌株），另一种策略通过 FRT-flanked 抗生素抗性基因筛选，最终仅留单个 FRT 疤痕（如替换为 OAgST、OAgSE、OAgSA的 L0136、L0133、L0137 菌株），全基因组测序证实了插入的准确性。
异源多糖表达与表型分析
初始构建的突变株（如 L0136、L0133、L0137）因大肠杆菌 W3110 的 Wzy 聚合酶无法识别沙门氏菌的 Und-PP-linked 重复单元，银染色和 Western blot 未检测到明显 LPS 条带。通过导入携带沙门氏菌 wzy 和 / 或 wzzB 基因的质粒（如 pET9a-wzyST、pET9a-(wzy-wzzB)ST），成功互补功能，使突变株产生具有紧密链长分布的 LPS，且同时表达 wzy 和 wzzB 时链长更长。流式细胞术显示，工程菌表面 LPS 表达量甚至高于野生型沙门氏菌，证实了异源多糖的高效合成。此外，插入 viaB_locus 的 L0149 菌株成功表达 Vi 荚膜抗原，Western blot 检测到特异性信号。
LPS 产量与免疫原性评估
在 LB 培养基中，工程菌 LPS 产量约为野生型沙门氏菌的 1/4-1/8，回收率约为细菌干重的 1%，纯度通过 SDS-PAGE 和分光光度法验证。小鼠免疫实验表明，使用完全弗氏佐剂（CFA）和不完全弗氏佐剂（IFA）的免疫组诱导出高水平的抗多糖 IgG 抗体，而无佐剂组以 IgM 为主。接种携带 wzy-wzzBST的工程菌（如 L0169、L0170）的小鼠，在攻毒实验中对 S. Paratyphi A 和 S. Typhimurium 表现出显著保护作用，揭示了异源抗原的免疫保护潜力。
研究通过自杀载体介导的染色体编辑技术，建立了一种便捷可靠的基因组糖工程方法，实现了非致病性大肠杆菌中异源碳水化合物抗原的高效、稳定生产。该方法避免了质粒系统的代谢负担和抗生素依赖，为碳水化合物疫苗的开发提供了安全、经济的平台。工程菌不仅可用于合成多种沙门氏菌属的 O 抗原和 Vi 抗原，还可扩展至糖结合疫苗、糖工程微细胞或外膜囊泡（OMVs）、多糖诊断试剂等领域，展现了在生物医药领域的广泛应用前景。此外，研究为细菌表面多糖的异源表达机制提供了新见解，推动了糖工程与疫苗学的交叉发展。
