在转录组研究中，RNA-seq技术已成为基因表达分析的黄金标准，但实验参数的优化仍是困扰研究者的难题。PCR扩增作为文库构建的关键步骤，其循环次数和起始RNA量的选择直接影响数据质量——过度扩增会导致重复序列增加，而起始量不足则可能丢失低表达基因信息。更复杂的是，随着Element AVITI、Singular G4等新型测序平台的出现，跨平台兼容性问题也亟待解答。

瑞士联邦理工学院苏黎世分校联合哈佛医学院等机构的研究团队在《Genome Biology》发表的重要研究，首次系统评估了起始RNA量（1-1000 ng）和PCR循环数在四种主流测序平台（Illumina NovaSeq 6000/X、Element AVITI、Singular G4）上对数据质量的影响。通过UMI（Unique Molecular Identifiers）标记和生物信息学分析，揭示了参数选择与数据质量的量化关系，为实验设计提供了精准指导。

研究采用NEBNext Ultra II定向RNA文库制备试剂盒构建文库，通过人类肝脏RNA梯度稀释（1-1000 ng）模拟不同起始量条件，设置低/中/高三种PCR循环数（相差2个循环）。利用UMI标记区分真实转录本与PCR重复序列，通过STAR比对和Qualimap质量评估，比较了四种测序平台的原始数据质量、重复序列率、基因检出数等关键指标。

Featured datasets
研究设计涵盖9个RNA输入梯度（1-1000 ng）和阴性对照，采用Illumina UDI接头构建文库后，分别在原生Illumina平台和经转换的AVITI/G4平台测序。这种多平台平行比较策略首次实现了跨系统数据质量的标准化评估。

Raw read quality evaluation
测序质量评分显示所有平台Phred值均>36（AVITI最高达43），但G4的错配率比其他平台高50%。值得注意的是，Illumina平台短读段（<18 bp）污染率达5.6-70.1%（低起始量样本），而经转换的AVITI/G4文库仅含0.009-3.3%的引物二聚体，证明转换步骤能有效净化文库。

Number of artifactual reads
当起始量<125 ng时，PCR重复序列率呈"双因素调控"特征：7 ng样本重复率高达96%，而125 ng时降至8-18%。关键发现是62 ng样本在中等与高循环数条件下，重复率会从34-42%跃升至50-60%，证明PCR循环数的微小差异即可显著影响数据质量。

Number of detected genes
基因检出数与起始量呈正相关（1 ng检出5013个基因 vs 1000 ng检出14536个）。在7 ng样本中，高循环数组比中/低循环数组少检出50%基因，而62 ng时差异缩小至5%。平台间比较显示，>125 ng样本中85%基因能被所有平台一致检出，证实跨平台数据的可比性。

Low input amounts yield distorted counts
对1582个核心基因的分析显示，起始量解释30%的表达变异，而PCR循环数仅贡献7%。特别在<31 ng样本中，高循环数组的Top20高表达基因计数比低循环数组低2-5%，表明过度扩增会压缩动态范围。UMI去重使<125 ng样本的平台间相关性提升，但在<7 ng样本中反而降低，提示极低起始量下技术噪音已超过UMI校正能力。

这项研究建立了RNA-seq实验参数的"安全阈值"：当起始量>250 ng时，PCR循环数差异几乎不影响结果；但对<125 ng样本，建议采用最低推荐循环数以最大限度保留基因信息。研究发现四种平台数据质量高度一致，但需注意G4的错配率较高、AVITI/G4转换会增加低起始量样本的重复序列率等技术细节。

该成果对精准医学研究具有重要指导价值：一方面为单细胞转录组、微量样本研究提供了参数优化标准，另一方面解决了跨平台数据整合的可靠性问题。研究者特别强调，对于临床样本等珍贵材料，应优先保证起始量而非依赖过度扩增，这对肿瘤异质性研究、罕见病转录组分析等前沿领域具有方法论意义。