抗 RANKL 治疗中断小鼠模型揭示骨重塑破坏导致骨量和骨质量下降

为探究地诺单抗（抗 RANKL）停药后多发椎体骨折风险增加的机制，研究人员构建小鼠模型，发现停药后出现破骨细胞活性 “反跳”、成骨细胞长期抑制，伴 RANKL+细胞外囊泡（EVs）蓄积和 osteoblast progenitor 减少。该研究为临床管理提供新机制 insights。

　　

骨质疏松是全球日益严峻的健康挑战，其核心是骨吸收（破骨细胞主导）与骨形成（成骨细胞主导）的动态平衡被打破。目前广泛使用的抗骨质疏松药物如地诺单抗（denosumab，一种靶向核因子 κB 受体活化因子配体 RANKL 的全人源单克隆抗体），通过抑制破骨细胞生成显著提升骨密度，但临床发现停药后患者面临椎体骨折风险激增的难题，且伴随骨代谢标志物抗酒石酸酸性磷酸酶 5b（TRAP-5b）显著升高的 “反跳” 现象。这种 “反跳” 背后的分子机制及骨量快速流失的病理过程一直未被充分阐明，严重制约了临床长期用药策略的优化。

为破解这一困境，日本昭和大学（Showa University）和顺天堂大学（Juntendo University）等机构的研究人员开展了深入研究。他们构建了抗 RANKL 抗体中断的小鼠模型，模拟人类停药后的骨代谢变化，结合临床样本分析，揭示了停药后骨重塑失衡的关键机制。相关研究成果发表在《Bone Research》，为理解地诺单抗停药后的骨损伤机制提供了重要科学依据。

研究主要采用了以下关键技术方法：

1. 动物模型构建：建立三注射（多次给药）和单注射抗 RANKL 抗体小鼠模型，以及去卵巢（OVX）骨质疏松小鼠模型，模拟人类停药场景和绝经后激素变化背景。
2. 临床样本分析：纳入 8 例接受多地诺单抗注射后停药超 10 个月的患者，检测血清 TRAP-5b、骨密度（BMD）等指标。
3. 影像学与组织形态学：利用活体 micro-CT 动态监测骨量变化，傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析骨组织成分，TRAP 染色和甲苯胺蓝染色评估破骨 / 成骨细胞活性及骨结构。
4. 细胞与分子生物学：流式细胞术分析破骨细胞前体（c-kit⁺CD11b^dul/-c-fms⁺等表型）和成骨祖细胞（如 Sca-1⁺PDGFRα⁺的 PαS 细胞）数量，ELISA 检测血清 RANKL/OPG 比值，免疫印迹和免疫电镜分析细胞外囊泡（EVs）中的 RANKL 表达。

研究结果

1. 抗 RANKL 停药后小鼠骨量快速流失且持续恶化

在三注射模型中，小鼠停药 6 周后血清 TRAP 水平显著升高，10 周时达峰值，伴随胫骨和股骨中破骨细胞标志物 Acp5、Ctsk mRNA 表达增加。活体 CT 显示，停药后 10-12 周骨量快速下降，且 16 周时骨量仍显著低于对照组，提示骨流失持续存在。micro-CT 进一步显示，股骨和脊柱的皮质骨密度、小梁骨体积 / 数量及皮质厚度均显著降低，骨微结构恶化，力学测试表明骨脆性显著增加，最大载荷、断裂力和刚度下降，证实停药后骨质量与结构均受损。

2. 成骨细胞功能长期抑制与祖细胞减少

停药初期（8 周），破骨细胞数量、侵蚀表面显著增加，而成骨细胞表面、类骨质厚度及矿化表面等成骨指标同步下降，提示骨吸收与形成的 “偶联” 机制破坏。值得注意的是，即使停药 16 周（反跳期结束后），成骨细胞数量和骨形成率仍未恢复，血清碱性磷酸酶（ALP）持续低水平。进一步研究发现，骨 marrow 中成骨祖细胞（如 ALP⁺早期成骨细胞、PαS 细胞）数量显著减少，提示成骨谱系细胞的长期耗竭是骨形成抑制的关键原因。

3. 破骨细胞前体蓄积与 RANKL⁺EVs 驱动反跳性骨吸收

停药前（末次注射后 2 周），小鼠骨髓中破骨细胞前体（c-kit^high/int/lowCD11b^dul/-c-fms⁺、CD11b^dul/-Ly6C^high等表型）显著扩增。血清中分离的 EVs（包括凋亡小体 AB、微囊泡 MV、外泌体 Ex）均携带 RANKL，且抗 RANKL 治疗期间 EVs 蓄积。体外实验表明，这些 EVs 可显著促进破骨细胞生成，而 EVs 耗竭血清则抑制该过程。机制上，抗 RANKL 抗体通过结合 EVs 表面 RANKL，抑制巨噬细胞对 EVs 的吞噬清除，导致停药后蓄积的 RANKL⁺EVs 大量释放，触发破骨细胞 “爆发式” 生成。

4. 抗 RANKL 停药效应的特异性与绝经后加速作用

对比抗 RANKL 抗体与双膦酸盐停药模型发现，后者未出现骨量显著下降和 EVs 蓄积，证实反跳现象是抗 RANKL 治疗特有的。在 OVX 小鼠中，单次抗 RANKL 注射即可引发 TRAP 反跳，且多次注射后皮质骨和脊柱 BMD 显著降低，提示绝经后状态加速停药后的骨代谢紊乱，可能与雌激素缺乏加剧破骨细胞前体敏感性有关。

研究结论与意义

本研究首次系统揭示了抗 RANKL 治疗中断后骨流失的双重机制：

1. 短期破骨反跳：治疗期间蓄积的破骨细胞前体与 RANKL⁺EVs 在停药后协同作用，引发快速骨吸收。
2. 长期成骨抑制：成骨祖细胞（如 PαS 细胞）数量持续减少，导致骨形成无法恢复，最终形成 “吸收 - 形成解偶联” 的恶性循环。

这些发现解释了临床地诺单抗停药后骨折风险增加的现象，提示需关注停药后的成骨细胞功能保护和 EVs 介导的破骨激活。同时，研究为开发新型干预策略（如调控 EVs 清除、促进成骨祖细胞增殖）提供了靶点，对优化骨质疏松长期治疗方案具有重要指导意义。未来研究可进一步探索 RANKL-EVs 在其他疾病（如肿瘤骨转移）中的作用，拓展该机制的临床应用价值。