双环肽类新型非β-内酰胺抗生素的发现与优化：靶向大肠杆菌PBP3的抗菌机制研究

为解决β-内酰胺类抗生素耐药性问题，研究人员通过噬菌体展示技术开发了靶向大肠杆菌PBP3的双环肽类抑制剂。该研究结合X射线晶体学解析结合模式，并通过偶联抗菌肽突破革兰阴性菌外膜渗透屏障，获得对肠杆菌目细菌具有广谱活性的非共价结合抑制剂，为抗耐药菌药物开发提供了新策略。

　　

抗生素耐药性已成为全球公共卫生的重大威胁，尤其是革兰阴性菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性日益严重。这类抗生素通过共价结合青霉素结合蛋白(PBPs)抑制细胞壁合成，但β-内酰胺酶的水解作用和靶点突变导致其疗效下降。尽管已有新型β-内酰胺酶抑制剂问世，开发非β-内酰胺结构的PBP抑制剂仍是突破耐药性瓶颈的关键。

Bicycle Therapeutics等机构的研究人员利用专有噬菌体展示平台，成功开发出靶向大肠杆菌PBP3(EcPBP3)的双环肽类抑制剂。这类分子通过独特的"8"字形构象非共价结合EcPBP3转肽酶活性中心，结合面积达1832 ?²，是传统β-内酰胺药物的两倍。研究进一步通过偶联穿透外膜的抗菌肽DRAMP18563，解决了双环肽分子量(约2000 Da)超出革兰阴性菌外膜孔道限值(约600 Da)的递送难题。该成果发表于《Communications Biology》，为抗耐药菌药物开发开辟了新路径。

关键技术包括：(1)噬菌体展示筛选双环肽库；(2)表面等离子共振(SPR)和荧光偏振(FP)测定结合亲和力；(3)X射线晶体学解析复合物结构(PDB:8RTZ)；(4)超孔化大肠杆菌株(GKCW102)全细胞活性筛选；(5)抗菌肽偶联策略优化膜渗透性。

高亲和力双环肽抑制剂的发现
通过28种双环肽格式库的4轮噬菌体展示筛选，从576个克隆中鉴定出15个候选序列。其中肽2(KD=5.23 nM)通过BOCILLIN-FL竞争实验和SPR验证其特异性结合EcPBP3活性位点，且不与其他E. coli PBPs结合。

结构机制解析
1.5 ?分辨率晶体结构显示，肽2以"8"字形构象占据EcPBP3催化裂隙，其色氨酸(Trp6)与Tyr541/Tyr511/Lys499组成的"疏水墙"相互作用，苯丙氨酸(Phe2)延伸至β-内酰胺未触及的新口袋。与哌拉西林相比，其埋藏表面积增加93%，但催化丝氨酸(Ser307)仍保持游离状态。

全细胞活性优化
在表达FhuAΔC/Δ4L孔道的超孔化菌株中，肽2的MIC达0.5-2 μg/mL。通过丙氨酸扫描和单残基库筛选发现：Trp6和Phe2为关键结合残基，替换为6-氯色氨酸(6ClTrp)可使亲和力提升至0.269 nM；而溶剂暴露的Lys4替换为高精氨酸(HArg)可增强蛋白酶稳定性。

抗菌肽偶联策略
将肽2与逆序全D型抗菌肽DRAMP18563偶联后(偶联物2)，对野生型E. coli的MIC降至4-8 μg/mL，且无溶血毒性(>100 μM)。对照实验证实活性依赖PBP3抑制，因为非结合型D-氨基酸类似物(偶联物3)活性降低32倍。

稳定性与广谱性
N端封端和6ClTrp修饰使小鼠血液半衰期>10小时。偶联物对ftsI基因同源性>94%的肠杆菌目细菌保持活性，包括临床耐药菌株。

该研究首次证明双环肽可作为非β-内酰胺类PBP抑制剂，其创新性体现在：(1)通过噬菌体展示快速获得高选择性抑制剂；(2)结构指导的亲和力优化策略；(3)抗菌肽偶联突破外膜屏障。这种"靶向+递送"双功能设计为应对多重耐药革兰阴性菌感染提供了新思路，未来需进一步优化药代动力学特性并评估体内疗效。