基于结构的NEDD4 HECT连接酶高效选择性抑制剂设计及其在癌症治疗中的潜在应用

为解决NEDD4（神经前体细胞发育下调蛋白4）作为癌症治疗靶点缺乏特异性抑制剂的问题，研究人员通过结构解析发现抗抑郁药Norclomipramine通过结合NEDD4的Ub外位点（Ub exosite）抑制泛素链延伸，并以此设计出靶向非催化半胱氨酸C627的共价抑制剂。化合物32（IC50=0.12μM）展现出对NEDD4家族成员的选择性抑制，保留单泛素化功能的同时阻断多聚泛素化，且具有口服生物利用度，为NEDD4依赖性肿瘤治疗提供了新策略。

　　

在癌症治疗领域，靶向泛素-蛋白酶体系统（UPS）的策略已取得显著进展，如蛋白酶体抑制剂硼替佐米（Bortezomib）和卡非佐米（Carfilzomib）的临床应用。然而，作为UPS核心组分的E3泛素连接酶（E3 ligases）因其复杂性和高度保守性，特异性抑制剂的开发一直面临挑战。其中，NEDD4（Neural precursor cell expressed developmentally down-regulated 4）作为HECT（Homologous to E6AP C Terminus）家族的代表性成员，在多种癌症中过表达并促进肿瘤进展，但其特异性抑制剂的缺乏限制了靶向治疗的探索。

此前研究发现，三环类抗抑郁药Norclomipramine可抑制HECT型E3的催化活性，但其机制不明且亲和力较低。为解决这一问题，来自欧洲肿瘤研究所（IEO）等机构的研究团队通过结构生物学和药物化学手段，揭示了Norclomipramine通过占据NEDD4的泛素外位点（Ub exosite）阻断泛素链延伸的独特机制，并以此设计出首个靶向非催化半胱氨酸C627的高选择性共价抑制剂，相关成果发表于《Communications Chemistry》。

研究团队运用了以下关键技术：1）X射线晶体学解析NEDD4 HECT结构（分辨率2.12?）；2）基于时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）的泛素化活性检测；3）CRISPR-Cas9构建NEDD4敲除细胞系；4）质谱分析（LC-MS/MS）验证抑制剂靶点特异性；5）药代动力学（ADME）评估。

Norclomipramine抑制泛素链延伸的机制
通过晶体结构（PDB 9H9O）发现，Norclomipramine的三环结构嵌入NEDD4 N叶（N-lobe）的疏水口袋，与泛素C端尾部（Ub残基71-76）的结合位点重叠，竞争性抑制K63多聚泛素链形成（图1D），但不影响E2→E3的硫酯转移反应（图1B）。

共价抑制剂的设计与优化
基于结构发现C627邻近抑制剂结合位点，团队设计α,β-不饱和羰基（如丙烯酰胺）为弹头的共价抑制剂。化合物15（IC₅₀=0.69μM）通过四碳链与C627共价结合（图3B），且对NEDD4-Like（含F608空间位阻）和ITCH（C610位置差异）无活性（图4C）。

功能验证与选择性
化合物15仅抑制NEDD4介导的多聚泛素化（如WBP2和γ-ENaC），而单泛素化底物Eps15不受影响（图5A-C）。质谱分析证实其在细胞内仅结合NEDD4（图4G）。

先导化合物32的突破
通过结构-活性关系（SAR）优化，化合物32（IC₅₀=0.12μM）整合N-甲基吡唑和氰基，表现出最佳活性、选择性（表4）及口服生物利用度（F%=37.5%，表5）。

该研究首次阐明通过靶向Ub外位点选择性调控NEDD4活性的策略，克服了传统催化位点抑制剂的局限性。化合物32的独特机制——保留单泛素化生理功能的同时阻断致癌性多聚泛素化——为NEDD4依赖性肿瘤提供了精准治疗可能。此外，C627的家族特异性分布为设计其他HECT E3（如ITCH的C610）抑制剂提供了模板。未来研究将聚焦于化合物32的体内抗肿瘤效果评估，以及基于单泛素化定向调控的化学探针开发。