基于RNA-Seq数据的VarRNA方法揭示癌症致病变异等位基因特异性差异表达

研究人员开发了新型计算工具VarRNA，通过XGBoost机器学习模型从肿瘤RNA-Seq数据中精准分类SNV和indel变异（区分胚系/体细胞/假象），在儿童癌症队列验证中识别出50%的DNA外显子组变异及独特RNA编辑事件，首次发现致癌基因中变异等位基因表达显著高于DNA预测水平，为癌症机制研究和精准治疗提供新视角。

　　

癌症基因组学研究长期面临肿瘤样本量不足的困境，当活检组织稀缺时，DNA测序往往难以开展。而RNA作为DNA的转录产物，不仅能反映基因表达动态，还携带遗传变异信息，却因RNA编辑、剪接复杂性等技术挑战，导致传统方法难以区分肿瘤特异性突变与转录噪声。更关键的是，现有RNA变异检测工具多针对正常组织胚系变异设计，无法解决肿瘤样本中体细胞突变识别、等位基因表达失衡（Allele-Specific Expression, ASE）等核心问题。

为解决这些难题，美国Nationwide Children's Hospital等机构的研究团队开发了VarRNA——首个专门针对肿瘤RNA-Seq数据的变异分类系统。这项发表于《Communications Medicine》的研究通过双重XGBoost模型，实现了单核苷酸变异（SNV）和插入缺失（indel）的精准分类，不仅识别出外显子组测序（Exome Sequencing, ES）50%的变异，更首次发现致癌基因中变异等位基因表达水平远超DNA预测的现象。例如MSH6基因突变在DNA中呈杂合状态（VAF 44.1%），而RNA中变异等位基因表达竟高达94.2%，揭示了错配修复缺陷导致超突变表型的关键机制。

关键技术方法包括：1）使用儿童癌症队列（NCH，n=77）和成人胶质母细胞瘤（GBM，n=9）的配对肿瘤/正常DNA外显子组测序作为金标准；2）STAR双通道比对和GATK HaplotypeCaller进行RNA变异初筛；3）通过覆盖度过滤（≥10 reads）和区域注释（排除重复序列/非外显子区）优化数据质量；4）构建两个XGBoost分类模型（真变异vs假象、胚系vs体细胞），采用SHAP值解析特征重要性；5）利用ZERO Childhood Cancer Program（ZCC）数据集进行独立验证。

模型性能评估
VarRNA在测试集（8931个变异）中展现出优异性能：真变异召回率95.1%（假象过滤精度93.6%），胚系变异分类精度达97.3%。相较于GATK Variant Filtration，其AUPRC（精确召回曲线下面积）从0.786提升至0.961，假阳性率降低3倍。特别值得注意的是，在肿瘤纯度>80%的样本中，体细胞变异识别灵敏度提高35%，证实其对高质量样本的分析优势。

变异特征解析
SHAP分析揭示：群体频率（gnomAD AF_raw）是区分胚系变异的最强特征（OR=8.2），而临床致病性预测（ClinPred评分）和进化保守性（PhyloP>2）对体细胞变异判断贡献最大。研究还发现，支持变异等位基因的读长中位数（MFRL_ALT）异常增长会显著增加假象判定概率，这与DNA测序中长片段易产生测序误差的规律一致。

DNA与RNA变异谱差异
在44例NCH患者中，VarRNA检测到12,486个RNA特异性变异（占总量2.5%），其中62%源于DNA测序覆盖不足或捕获探针失效。典型案例如STAG2基因移码突变（DNA VAF 51.8% vs RNA VAF 97.4%），其RNA单等位基因优势表达提示Ewing肉瘤不良预后特征，这一发现仅通过DNA分析极易遗漏。

临床价值验证
在1例仅存RNA数据的儿童高级别胶质瘤中，VarRNA成功鉴定出FGFR1 p.N546K激酶域热点突变和PIK3R1 iSH2功能域缺失（6bp缺失），与脑脊液游离DNA检测结果完全一致。这些变异均被OncoKB数据库列为Ⅰ/Ⅱ级临床可操作靶点，证实了该方法在微量样本中的临床应用潜力。

这项研究开创性地建立了肿瘤RNA-Seq变异分析的标准化流程，其核心突破在于：1）首次实现无配对照样本的体细胞突变识别；2）揭示致癌基因中变异等位基因的"表达优势"现象；3）提供RNA编辑事件的系统检测方案。从转化医学角度看，VarRNA使临床医生能够利用常规转录组数据获取突变谱和表达调控信息，尤其适用于穿刺小样本分析。未来通过整合单细胞测序和表观组学数据，该方法有望进一步解析肿瘤异质性背后的分子机制，为个体化治疗策略制定提供多维依据。