飞秒级串行晶体衍射揭示细菌光敏色素变体Agp2-PAiRFP2中发色团与蛋白质结构变化的耦合机制

本研究通过时间分辨串行飞秒X射线晶体学（tr-SFX）结合泵浦-探测技术，解析了细菌光敏色素变体Agp2-PAiRFP2从Pfr态到Pr态光转换过程中7个时间节点的结构变化。研究首次在室温下捕捉到发色团异构化、质子转移和蛋白质构象转变的耦合过程，发现Gln190-Trp440分子开关是触发PHY结构域"舌状区"（tongue）二级结构转变的关键，为理解光敏色素信号转导机制提供了原子尺度动态视角。

　　

在生命的光感知系统中，光敏色素（phytochrome）作为自然界最精妙的光开关之一，通过发色团（chromophore）的光异构化触发蛋白质构象变化，进而调控基因表达、生物节律等重要生理过程。然而这个分子开关如何将纳米尺度的光化学变化转化为微米尺度的蛋白质构象变化，一直是结构生物学领域的未解之谜。传统冷冻晶体学只能捕捉稳定态结构，而室温下的动态过程如同被封印在时间琥珀中，使得研究者难以窥见光激活过程中关键瞬态中间体的真实面貌。

针对这一挑战，来自多个研究机构的国际合作团队选择细菌光敏色素变体Agp2-PAiRFP2作为研究对象。这个经过荧光优化的变体具有独特优势：其光反应终产物Meta-F态寿命显著延长，为捕捉中间态结构提供了时间窗口。研究人员采用时间分辨串行飞秒X射线晶体学（time-resolved serial femtosecond crystallography, tr-SFX）技术，在美国LCLS和日本SACLA两个X射线自由电子激光（XFEL）装置上，通过精确控制785/770 nm LED激发时间和X射线探测延迟，成功捕获了从皮秒到秒级时间尺度上的7个结构快照。

关键技术包括：1）使用声波液滴喷射（ADE）的"按需滴落"（drop-on-demand）样品输送系统实现室温晶体输送；2）三个不同空间位置的照明点（ILP1-3）实现毫秒到秒级的时间分辨；3）混合量子力学/分子力学（QM/MM）计算模拟发色团异构化路径；4）采用polder-omit和同晶差值（isomorphous F_o-F_o）电子密度图解析动态结构变化。

研究结果揭示了一个精密的级联反应过程：
【Group 1分子事件】在<30 ms时间尺度，发色团biliverdin（BV）的C15=C16键发生E→Z光异构化，构型从ZZEssa变为ZZZssa。QM/MM计算显示该过程伴随环D顺时针旋转和甲烯桥反向扭曲，形成80%异构化的Lumi-F中间态。

【Group 2分子事件】在30-100 ms阶段，发色团B/C环丙酸侧链（prop-B/prop-C）发生构象弛豫。prop-C位移引发Tyr²⁰⁵和Arg²¹¹重排，同时四个吡咯环共面性逐步增加，B-C桥扭转角从I1的35°降至I7的15°。

【Group 3分子事件】140-170 ms时，CBP（chromophore binding pocket）发生显著重构：Tyr¹⁶⁵旋转至Phe¹⁹²原位置，后者则通过疏水作用稳定环D；Gln¹⁹⁰外移导致其与Trp⁴⁴⁰的氢键网络破坏，为舌状区构变奠定基础。

【Group 4分子事件】3-6 s时间尺度，蛋白质骨架发生全局变化：Cys¹³与BV的连接方式从α-面转向β-面；舌状区441-445环段解折叠，该过程与N端重构协同进行。值得注意的是，在Agp2-PAiRFP2变体中，prop-C质子无法转移至His²⁷⁸，导致舌状区α→β转变被阻断。

这项研究首次完整描绘了光敏色素从发色团异构到蛋白质构象转变的全原子动态过程，提出Gln¹⁹⁰-Trp⁴⁴⁰相互作用是构象变化的分子开关。该发现不仅解释了bathy型光敏色素中Pfr→Pr光转换的共性机制，更重要的是建立了光化学变化与蛋白质功能调控的结构桥梁。技术层面，tr-SFX与QM/MM的结合为研究其他光敏蛋白的动态过程提供了范式。这些发现对设计新型光遗传学工具具有重要指导意义，相关成果发表在《Science Advances》期刊。