细菌光敏色素Agp2-PAiRFP2光激活过程的时序结构解析：从发色团异构化到蛋白质构象转换的分子机制

光敏蛋白如何将光信号转化为生理功能？德国研究人员通过时间分辨飞秒X射线晶体学（tr-SFX）技术，首次捕获了细菌光敏色素Agp2-PAiRFP2从Pfr态到Meta-F态的七组时序结构，揭示了发色团异构化、质子转移与蛋白质构象变化的耦合机制，为光遗传学工具开发提供新见解。

　　

在自然界中，光敏色素（phytochrome）如同生物的"光开关"，通过感知红光和远红光调控植物的生长周期、细菌的运动行为等生理过程。这类蛋白质的核心奥秘在于其发色团（chromophore）的光异构化反应，能触发蛋白质构象变化，进而激活下游信号通路。然而，这一动态过程如何精确发生时序性结构变化，尤其是早期光化学反应与后续蛋白质重构如何耦合，一直是结构生物学领域的未解之谜。

传统冷冻电镜技术虽能捕捉稳定态结构，却无法解析室温下快速动态过程。以德国马普学会为首的研究团队另辟蹊径，选择细菌光敏色素Agp2的荧光优化变体PAiRFP2为研究对象，利用X射线自由电子激光（XFEL）技术，首次实现了从皮秒到秒级时间尺度的完整光激活过程观测。相关成果发表于《SCIENCE ADVANCES》，为理解光敏蛋白的分子机制树立了新标杆。

研究团队采用时间分辨串行飞秒晶体学（tr-SFX）技术，在美国LCLS和日本SACLA装置上收集了从33毫秒到360秒的七组时间点数据。通过比较照明前后的电子密度差异图（F_o^illuminated?F_o^dark），结合量子力学/分子力学（QM/MM）计算，系统解析了光激活全过程。

黑暗适应的Pfr基态结构
初始结构显示发色团胆绿素（BV）呈ZZEssa构型，α-面结合Cys¹³，与Tyr¹⁶⁵、His²⁷⁸等形成氢键网络。PHY结构域的"舌头"（tongue）区域呈现典型α-螺旋构象，为后续构象变化提供参照基准。

分子事件分组解析
第一组事件（<30毫秒）聚焦发色团异构化。光照33毫秒后，80%的BV完成C15=C16键的Z→E异构化，转变为ZZZssa构型。QM/MM模拟揭示该过程伴随环D顺时针旋转和环C反向位移，形成能量最低的激发态构象。

第二组事件（30-100毫秒）展现结构松弛过程。BV的B、C环丙酸侧链（prop-B/prop-C）发生位移：prop-B与Arg²⁴²形成双齿结合，prop-C则推动Tyr²⁰⁵位移，进而引发Arg²¹¹旋转。此时四个吡咯环共平面性增强，B-C桥扭转角从初始34°降至22°。

第三组事件（140-170毫秒）涉及结合口袋重构。Tyr¹⁶⁵和Phe¹⁹²发生显著旋转，前者占据后者原始位置，后者则通过疏水作用稳定新构象。保守水分子网络重组，特别是吡咯水（pyrrole water）与Asp¹⁹⁶的相互作用减弱，为后续质子转移创造条件。

第四组事件（3-6秒）呈现蛋白质骨架变化。Cys¹³从α-面转向β-面结合，N端重构。关键开关Gln¹⁹⁰向外位移，破坏其与Trp⁴⁴⁰的氢键网络，导致舌头区域441-445环结构解离——这一构象变化在野生型中会触发α→β二级结构转变，但在PAiRFP2变体中因质子转移受阻而停滞。

这项研究首次完整描绘了光敏色素从发色团激发到蛋白质构象变化的全链条机制。特别值得注意的是，Meta-F态作为功能耦合的关键节点，其形成需要四步级联反应：发色团异构化引发局部结构扰动→侧链重排改变静电环境→氨基酸位移创造质子转移通道→最终通过Gln¹⁹⁰-Trp⁴⁴⁰相互作用传导至舌头区域。

技术层面，tr-SFX突破传统晶体学的时空限制，实现室温下的毫秒级动态捕捉。而通过比较LCLS与SACLA数据，发现晶体堆积效应会影响分子B的转换效率，凸显原位观测的重要性。这些发现不仅深化了对光敏蛋白工作机制的理解，更为设计新型光遗传学工具（如精确控制构象变化的合成光敏元件）提供了结构基础。未来研究可进一步探索质子转移与舌头构象转变的原子细节，推动人工光控系统的发展。