疏水残基替换增强呼吸道合胞病毒融合蛋白稳定性与体内免疫原性的机制研究

本研究通过引入四个疏水残基突变（N67I、S190F、V207L、S215P）构建了高稳定的RSV F蛋白三聚体（pre-F-IFLP），其细胞表达量显著提升，且具有优异的耐热性、酸碱稳定性及长期储存能力。动物实验显示，pre-F-IFLP诱导的中和抗体效价较第一代疫苗DS-Cav1提升72倍，并完全保护小鼠免受RSV感染，为开发高效RSV疫苗提供了新策略。

　　

ABSTRACT
呼吸道合胞病毒（RSV）通过其融合蛋白（F蛋白）介导宿主细胞入侵。F蛋白从亚稳态的前融合构象（prefusion F）转变为高度稳定的后融合构象（postfusion F），其中prefusion F能诱导更强的中和抗体反应，是疫苗开发的主要靶点。然而，prefusion F三聚体的天然不稳定性及低表达量制约了疫苗研发。本研究通过引入四个疏水残基突变（N67I、S190F、V207L、S215P），成功构建了高稳定性prefusion F三聚体pre-F-IFLP。该变体在细胞中表达量显著提升，且耐受高温、酸碱和长期储存。小鼠实验中，pre-F-IFLP二次加强免疫后中和抗体效价较DS-Cav1提高72倍，并完全阻断RSV感染。

IMPORTANCE
pre-F-IFLP通过疏水相互作用稳定三聚体结构，不仅克服了DS-Cav1的低表达缺陷，还显著提升了免疫原性。其诱导的高效中和抗体可完全阻断病毒与细胞膜结合及合胞体形成，为RSV疫苗设计提供了新思路。

INTRODUCTION
RSV是全球婴幼儿下呼吸道感染的主要病原体，每年导致数万儿童死亡。尽管已有两款基于prefusion F的疫苗（Arexvy和Abrysvo）获批，但其对高危人群的保护效力有限。DS-Cav1作为第一代prefusion F疫苗，因稳定性差和低表达量难以满足需求。本研究旨在通过理性设计突变，构建兼具高稳定性和强免疫原性的prefusion F变体。

RESULTS
设计细胞膜稳定的prefusion RSV F突变体
通过流式细胞术和荧光显微镜观察，发现Cav1突变（S190F、V207L）可提升prefusion F比例，但DS突变（S155C、S290C）降低表达量。组合Cav1与DM突变（N67I、S215P）的pre-F-IFLP_ct在55℃仍保持稳定，且膜融合活性显著降低。

ectodomain变体的稳定性评估
点印迹实验显示，pre-F-IFLP在pH 3.5-10和25℃储存30天后仍保留大部分prefusion构象，而DS-Cav1在相同条件下迅速转变为postfusion F。

pre-F-IFLP的抗原特性
表面等离子共振（SPR）分析表明，pre-F-IFLP与prefusion特异性抗体D25的结合亲和力（K_D <0.024 nM）较DS-Cav1（K_D=0.282 nM）提升11.7倍，且三聚体结构经非还原电泳验证。

小鼠免疫中和效果
两次免疫后，pre-F-IFLP组血清中和效价（ID₅₀）较DS-Cav1组高26倍，且抗体结合/中和效价比降低，表明其诱导的抗体更高效。三次免疫后，中和效价进一步提升至64,000，病毒载量减少2068倍，肺部病理损伤显著减轻。

DISCUSSION
疏水突变通过增强三聚体内部相互作用稳定prefusion F，避免了外源二硫键对天然构象的干扰。pre-F-IFLP的高表达量和强免疫原性使其成为mRNA或病毒载体疫苗的理想候选。未来需通过结构解析进一步阐明疏水残基对构象稳定的分子机制。

MATERIALS AND METHODS
实验采用HEK293T细胞表达RSV F变体，通过Ni柱和分子筛纯化蛋白。小鼠免疫采用AddaVax佐剂，中和实验使用TCID₅₀法，肺部病理评分采用H&E染色。数据以均值±SEM表示，统计学差异通过双尾t检验评估。