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为解决 RNA 复制中 “链分离问题”，研究人员开展 RNA 聚合酶核酶（TPR）催化 RNA 复制研究。发现三核苷酸三磷酸（pppNNN）可稳定单链 RNA，结合 pH - 冻融循环实现双链 RNA 指数复制，还使随机序列池向原始密码子漂移，为模拟原始 RNA 复制提供新路径。
生命的诞生与演化离不开遗传物质的精准复制。在地球生命起源的假说中，RNA 世界理论认为 RNA 曾同时承担遗传信息存储与催化功能，但 RNA 复制面临一个核心难题 ——“链分离问题”。由于 RNA 双链（RNA duplex）具有极高的稳定性（熔解温度接近水的沸点），且单链 RNA 在解离后极快重新退火（秒到分钟级），远快于非酶或核酶催化的复制反应速度（小时到数天），导致传统条件下 RNA 复制在动力学和热力学上均难以进行。此外，RNA 的化学不稳定性（如 Mg2?介导的酯交换降解）限制了高温等剧烈解链条件的应用，使得长链 RNA 的复制与演化成为亟待突破的科学瓶颈。
为攻克这一难题，英国医学研究理事会分子生物学实验室（MRC Laboratory of Molecular Biology）与伦敦大学学院（UCL）的研究团队开展了系列研究，相关成果发表在《Nature Chemistry》。研究聚焦于利用三核苷酸三磷酸（trinucleotide triphosphates，简称 pppNNN 或 triplet）作为底物，结合 pH 调控与冻融循环，探索 RNA 聚合酶核酶（triplet polymerase ribozyme，TPR）催化的开放式 RNA 复制机制。
研究技术方法
研究采用的关键技术包括：
- 荧光淬灭分析：检测 RNA 双链解离与退火动力学，验证酸性 pH 对双链稳定性的影响。
- pH - 冻融循环体系：通过酸性 pH（pH≤3.6）解离 RNA 双链，中性化后快速冻融（-7°C）浓缩溶质，创造 TPR 催化聚合的理想微环境（高 Mg2?浓度、低水活度）。
- 变性凝胶电泳与测序：分析 RNA 复制产物的长度、序列组成及演化轨迹，结合下一代测序技术解析随机序列池的动态变化。
- 核酶催化活性测定：通过引物延伸实验量化 TPR 在不同条件下的聚合效率与产物保真度。
研究结果
1. 三核苷酸底物抑制链退火的双重作用
pppNNN 不仅作为复制底物，还能通过碱基配对 “包裹” 单链 RNA，抑制其重新退火。实验表明，GC 富集的 pppNNN（如 pppCCC、pppGCG）在低浓度（~2.5 μM）即可有效阻止 30 nt GC-rich 双链（A?，预测 Tm=99°C）的再退火，而 AU 富集底物效果较差。这种 “底物辅助复制” 机制使单链 RNA 在中性化后保持解离状态长达 300 小时以上，为 TPR 催化聚合提供充足时间窗口。
2. pH - 冻融循环驱动的迭代复制
通过交替酸性解链（pH 3.6，80°C）与冻融聚合（pH 9，-7°C），实现了双链 RNA 的指数复制。以 30 nt 模型双链 A?为例，经过 4 个循环，正链（A?）和负链（A?）产量分别达到初始模板的 104% 和 207%，显示出双链的不对称复制特性。延长至 21 个循环并结合稀释体系，A?产量实现 31 倍扩增，证明该体系可支持长周期复制。
3. 开放式 RNA 扩增与序列演化
在随机序列库（N??）的复制中，研究观察到产物从全长片段逐渐演化为更短的优势序列（+8 nt、+11 nt、+14 nt），其扩增效率达每循环 1.27-1.37 倍。测序表明，这些序列富含 GC 三联体，部分形成互补引物结合位点，类似 PCR 中的引物效应。更令人关注的是，无引物复制体系中，随机序列池（N??）经 73 个循环后，约 80% 序列向 “家族盒密码子”（family box codons，编码氨基酸时第三位碱基不影响对应氨基酸）漂移，暗示复制压力可能推动序列向原始遗传密码方向演化。
4. 核酶片段的自复制与模板交叉利用
TPR 催化核心片段（γ 片段，29 nt）可实现部分自复制，在 5 个循环内产量提升 1.26 倍 / 循环。值得注意的是，即使无外源模板，TPR 自身降解产物也能作为模板起始复制，生成与 TPR 序列互补的 RNA 链，表明核酶可通过 “碎片化自复制” 逐步积累功能片段。
研究结论与意义
本研究揭示了三核苷酸底物通过 “分子伴侣 - 底物” 双重功能克服链分离问题的机制，建立了 pH - 冻融循环驱动的 RNA 指数复制体系。关键突破包括：
- 突破复制瓶颈：pppNNN 的 “链包裹” 效应首次实现了热力学稳定双链的高效解离与单链保护，使长链 RNA（>30 nt）的酶促复制成为可能。
- 模拟原始演化：开放式复制体系中观察到的序列向家族盒密码子漂移，为解释遗传密码的起源提供了物理化学层面的证据，暗示复制选择性可能驱动早期翻译系统的形成。
- 核酶自复制路径：TPR 通过碎片化模板交叉利用实现部分自复制，为设计自维持的 RNA 复制系统奠定了基础，助力 “RNA 世界” 假说的实验验证。
该工作不仅为理解生命起源中的关键化学过程提供了新模型，还为合成生物学中无酶核酸扩增、原始遗传系统模拟等领域开辟了新方向。未来研究可进一步探索该体系在跨链催化、功能 RNA 筛选中的应用，深化对 RNA 多维度生物学角色的认知。
