编辑推荐：
提取和采样方法可能导致 DNA 分析偏差，改变分类组成。为探究更优提取方法，研究人员对糙海参肠道微生物组开展研究，采用 3 种直接提取法，测序 ITS 和 16S rDNA 区域，获不同解剖区域微生物多样性特征，为相关研究奠定基础。
本研究利用直接机械（冻融）、酶（溶菌酶）和化学（十二烷基硫酸钠 SDS、异硫氰酸胍 GITC 作为变性剂）提取方法，获取海洋无脊椎动物糙海参（Holothuria glaberrima）的肠道微生物组。通过对 ITS 和 16S rDNA 区域测序，富集并研究海参肠道生物学不同解剖区域的原核和真菌多样性特征。
实验于 2022 年 8 月 5 日从波多黎各圣胡安 Pi?ones 海滩（18.451141, ?65.905634）采集 13 份标本，在诱导内脏切除前将其饲养于海水水族箱中。样本分为完整消化系统（DS）、洗涤肠（WI）、洗涤内容物（CW）和粪便内容物（FC）。对宏基因组 DNA 进行提取后，将相应 DNA 样本以等摩尔浓度合并（FC 9 份、WI 6 份、CW 6 份、DS 7 份），以获得更具代表性的微生物群落基线特征，并通过凝胶电泳确认合并 DNA 的存在和完整性。16S rDNA 测序使用引物 341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）和 785R（GACTACHVGGGTATCTAATCC），ITS1-2 扩增使用 ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）和 ITS2R（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）引物，将文库归一化至最终浓度 4.0 nM 后，在 Illumina MiSeq 上进行 30 轮测序。
数据使用 QIIME2（amplicon-2024.5）分析（默认参数，除非另有说明），Cutadapt 用于去除引物，DADA2（1.30）进行去噪，16S rDNA 和 ITS 的参数分别设置为 “p-trunc-len 141” 和 “p-trunc-len 113”，分别获得 659,193 条和 478,708 条高质量读数。在 100% 相似性阈值下，16S rDNA 和 ITS 数据分别聚为 2,296 个和 2,210 个扩增子序列变体（ASVs）。
ITS 分析显示，DS 中最丰富的真菌目为 Eurotiales（64.9%）和未分类真菌（11.2%）；WI 中为未分类真菌（25.3%）和 Agaricales（23.5%）；CW 中为 Agaricomycetes（44.2%）和 Mycosphaerellales（20.7%）；FC 中为 Hymenochaetales（26.3%）和 Agaricales（13.7%）。16S 分析显示，DS 中最丰富的目为 Micrococcales（69.1%）和 Enterobacterales（8.3%）；WI 中为 Enterobacterales（23.8%）和 Campylobacterales（22.5%）；CW 中为 Enterobacterales（33.8%）和 Campylobacterales（17.1%）；FC 中为 Bacteroidales（9.2%）和 Rhizobiales（8.0%）。该初步分类基线将有助于研究糙海参微生物组在再生中可能发挥的作用。
美国国家科学基金会（NSF）在资助号 2100494 下为本研究提供了支持。
