在遗传诊断领域，外显子测序(ES)和基因组测序(GS)的应用虽然将孟德尔疾病的诊断率提升至约50%，但仍有大量变异因功能证据不足而难以分类。RNA测序(RNA-seq)作为补充技术，理论上可增加7-36%的诊断率，却面临两大瓶颈：难以获取病变组织样本，以及RNA数据分析的复杂性。特别是对于神经发育障碍等疾病，传统方法往往无法捕捉组织特异性表达基因的异常剪接事件，而无义介导的mRNA降解(NMD)机制更会掩盖关键转录本异常。

比利时根特大学医学遗传学中心的研究团队在《npj Genomic Medicine》发表的研究中，创新性地开发了基于外周血单核细胞(PBMC)的微创RNA测序方案。该方案通过短期培养PBMC并结合环己酰亚胺(CHX)处理抑制NMD，成功在临床可及组织中实现了高效转录组分析。研究显示，在智力障碍和癫痫基因panel中，PBMC可表达高达80%的相关基因，为神经发育障碍的诊断提供了理想样本来源。

研究采用三阶段技术路线：首先通过转录组测序评估四种临床可及组织(CAT)的基因表达谱；随后建立PBMC培养和CHX处理标准化流程；最后整合FRASER(异常剪接检测)、OUTRIDER(表达异常分析)和单等位基因表达(MAE)分析三大生物信息学工具。研究队列包含46例患者和15名父母对照，重点验证了9例已知剪接变异病例。

在"Up to 80% of our ID/epi panel genes are expressed in fibroblasts and PBMCs"部分，研究团队系统比较了成纤维细胞、全血、PBMC和淋巴母细胞系(LCL)四种CAT的表达谱。通过转录本每百万(TPM)>1的严格标准，发现PBMC在智力障碍和癫痫基因panel中表达79.7%的基因，仅次于成纤维细胞(80.4%)，显著优于全血(77.3%)和LCL(75.4%)。这一发现确立了PBMC作为神经发育障碍RNA研究的理想样本地位。

"Cycloheximide treatment can successfully inhibit NMD in CATs"章节验证了CHX处理的有效性。研究选用XPC、TPP1和PPT1基因的截短变异模型，通过qPCR证实CHX处理可使NMD敏感转录本表达提升2-3倍。特别引入SRSF2基因的NMD敏感异构体作为内参，发现CHX处理后其外显子3包含 reads从4.55%增至8.58%，为实验质量控制提供了可靠指标。

核心发现"RNA-seq outperforms in silico prediction tools and targeted cDNA analysis in capturing complex splicing events"显示，在9例剪接变异患者中，RNA-seq检出6例存在异常剪接，而传统cDNA分析仅检出4例。值得注意的是，在SMARCC2和SETD1A病例中，RNA-seq成功捕捉到内含子保留这一复杂剪接模式，而Sanger测序因技术局限未能识别。与SpliceAI等预测工具相比，RNA-seq不仅能确认剪接异常，还能精确揭示变异的具体分子效应。

研究通过"RNA-seq improves variant classification for splice region variants"证明该技术的临床价值。依据ACMG指南重新分类后，7个变异获得升级：WDR26、NIPBL和SETD1A的变异因PVS1证据从3类升至5类(致病性)；SMARCC2变异因PS4_PM证据从3类升至4类(可能致病性)。而未被RNA-seq证实异常的3个变异则降级为2类(可能良性)，显著提高了诊断精确度。

在"FRASER analyses did not result in novel causal variants in our cohort"和后续章节中，研究团队评估了全局分析工具的诊断效能。虽然FRASER成功识别出87.5%的验证阳性剪接事件，但仅4例达到统计学显著性(p-adj<0.05)。OUTRIDER在4例已知拷贝数变异(CNV)患者中检测到相关基因表达异常，但对ZEB2等单基因病例敏感度有限。单等位基因表达分析虽平均检出405.9个MAE事件/样本，但未能发现新的致病基因。

研究提出的标准化流程(图8)具有重要临床指导意义：对于可疑剪接变异，建议先评估目标基因在PBMC中的表达水平；FRASER分析阴性时需手动检查IGV图谱；OUTRIDER检测到的表达异常需结合DNA数据重新评估；MAE分析应聚焦表型相关基因。这种分层策略平衡了检测灵敏度与临床实用性。

该研究的创新价值体现在三方面：技术上，PBMC培养仅需72小时，配合CHX处理可稳定捕获NMD敏感转录本，大幅缩短诊断周期；临床上，为神经发育障碍提供了微创且高效的RNA诊断方案；科学上，通过46例患者队列系统验证了RNA-seq在变异解读中的增值效应。研究团队特别指出，随着长读长测序技术的发展，未来有望更全面解析复杂剪接事件，而本研究建立的PBMC平台为这一进化奠定了坚实基础。