基于荧光显微镜的贴壁细胞可及性高精度流式分析新方法开发及应用

为解决传统流式细胞术难以分析贴壁细胞的问题，加州大学旧金山分校Bo Huang团队开发了一种基于荧光显微镜的Python分析工具，通过优化Cellpose算法结合胰酶处理策略，实现了贴壁细胞的高精度单细胞荧光定量。该技术成功应用于88种prime editing（PE）条件的筛选，为基因编辑优化和内源蛋白标记研究提供了新方案。

　　

在生命科学研究中，流式细胞术（flow cytometry）是分析单细胞荧光信号的黄金标准，但其对贴壁细胞的适用性存在明显局限。传统方法需通过胰酶消化将贴壁细胞转化为悬浮状态，不仅可能损伤细胞，还会丢失细胞间的空间信息。更棘手的是，许多研究机构缺乏流式设备，而普通荧光显微镜虽普及却缺乏有效的单细胞定量工具。这种技术鸿沟严重制约了基因编辑、细胞异质性等前沿研究的进展。

针对这一挑战，加州大学旧金山分校Bo Huang团队在《Scientific Reports》发表创新成果。研究人员巧妙结合计算机视觉算法与细胞生物学方法，开发出显微镜流式分析技术（microscopy-based cytometry）。该技术通过优化细胞分割算法Cellpose和胰酶处理方案，首次实现了贴壁细胞的非破坏性、高精度单细胞荧光定量。

研究采用三大关键技术：1）基于Cellpose算法的细胞分割优化，系统测试525种参数组合；2）胰酶梯度处理策略比较（完全贴壁vs部分贴壁vs完全悬浮）；3）多平台验证体系，包括宽场显微镜（20X/60X）、EVOS低成本显微镜与流式细胞术的平行比对。

主要研究结果

胰酶处理显著提升分割精度
通过比较三种细胞状态（完全贴壁、胰酶部分处理、胰酶+重悬），发现短暂胰酶处理使细胞保持部分贴附状态时，Cellpose分割准确率最高（segments/核=1），假阴性率降低至5%以下。完全重悬反而导致过度分割（segments/核>1），而未经处理的贴壁细胞分割准确率仅30%。

光学系统性能超越流式
在信噪比（SNR）测试中，60X宽场显微镜（20.5）显著优于流式细胞仪（9.8），即使10X EVOS低成本显微镜（15.2）也优于流式。对于mApple荧光蛋白检测，显微镜系统的野生型背景信号变异系数（CV）更低，显示更高检测灵敏度。

Prime editing条件优化应用
将该技术应用于48bp长度的mNG₂₁₁片段插入β-actin基因的PE优化，发现：1）MLH1dn质粒浓度与编辑效率正相关（最高15.2 ng时达35% mNG⁺细胞）；2）高浓度MLH1dn抑制细胞增殖；3）综合考虑编辑效率与细胞存活，4.5 ng MLH1dn+5 ng PE质粒可获得最大mNG⁺细胞总量。

讨论与意义
这项研究突破了传统流式细胞术的技术边界，其创新性体现在三方面：首先，提出的"部分贴附"处理策略完美平衡了细胞分散度与形态完整性，使普通显微镜也能获得媲美流式的单细胞数据；其次，Cellpose参数优化方案为算法在生物学的应用树立了范式；最后，在prime editing优化中揭示的MLH1dn浓度悖论（提升编辑效率但抑制增殖），为基因编辑条件筛选提供了新维度。

该技术的开源工具（GitHub公开）将显著降低单细胞分析的门槛，特别有利于：1）缺乏流式设备的研究组；2）需要保留细胞空间信息的克隆分析；3）长片段基因插入等低效率事件的检测。未来通过整合更多荧光通道和3D成像，有望进一步发展成全方位的显微流式平台。