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本文聚焦微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）的钙依赖蛋白激酶（CDPKs），利用 CRISPR-Cas9 技术研究 CpCDPK2A 功能，发现其在虫体各阶段表达，尤其在运动期，敲除后显著影响发育和致病性，为抗隐孢子虫病药物开发提供新靶点。
微小隐孢子虫（
Cryptosporidium parvum）是引发人和动物中至重度腹泻的重要病原体，尤其对低中收入国家儿童和幼龄动物危害显著。当前针对隐孢子虫病的有效疫苗和药物匮乏，钙依赖蛋白激酶（CDPKs）因在虫体生命周期中起关键作用且在宿主中不存在，成为极具潜力的药物靶点。
研究方法与结果
研究运用 CRISPR-Cas9 技术，对C. parvum IIdA20G1-HLJ 株的CpCDPK2A基因进行内源性血凝素（HA）表位标记及基因敲除。免疫荧光分析（IFA）显示，CpCDPK2A 在虫体所有细胞内发育阶段均有表达，尤其在子孢子、裂殖子等运动阶段，其在滋养体和雌配子体中定位于细胞质，在卵囊、裂殖体和雄配子中则分布于表面且呈不均匀积累。
萤光素酶检测表明，CpCDPK2A基因敲除（Δcdpk2a）株在体外培养时，24 小时前与标记株生长速率无显著差异，但 36 小时后生长显著减缓，提示其对虫体晚期无性阶段和有性阶段发育至关重要。
体内致病性研究
在干扰素 -γ 敲除（GKO）小鼠模型中，Δcdpk2a 株感染小鼠的卵囊排出量较标记株降低约 25 倍，粪便萤光素酶活性降低 24 倍，体重下降更少，存活时间更长。组织学分析显示，Δcdpk2a 株感染小鼠回肠的虫体负荷更低，绒毛萎缩和隐窝增生程度显著减轻，绒毛长度与隐窝深度比值更接近正常水平。
讨论与意义
与其他 CDPKs（如仅在特定阶段表达的 CpCDPK1 和 CpCDPK5）不同，CpCDPK2A 在虫体全生命周期表达，其表面不均匀分布可能与 N - 肉豆蔻酰化修饰相关。尽管 CpCDPK2A 并非虫体存活必需，但其缺失显著影响晚期发育和致病性，提示其可作为阻断虫体传播的多阶段调控靶点。该研究为隐孢子虫病的防治策略开发，尤其是以 CpCDPK2A 为靶点的药物或疫苗设计提供了重要依据，后续需进一步探索其作用机制和疫苗潜力。
