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为探究 merbecovirus 亚属冠状病毒的人类威胁潜力，研究人员以嵌合刺突蛋白（spike）构建假病毒，分析受体趋向性。发现 HKU5 蝙蝠冠状病毒利用日本伏翼蝠（Pipistrellus abramus）ACE2 受体，其刺突三聚体结构仅呈现 “向下” RBD 构象，为冠状病毒跨物种传播风险评估及广谱疫苗开发提供依据。
在冠状病毒的大家族中，β 冠状病毒亚属的 merbecovirus 分支一直备受关注。中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）作为该分支的代表成员，自 2012 年被发现以来，已导致多次人类严重呼吸道感染疫情，其从单峰骆驼向人类的跨物种传播机制虽已部分阐明，但该亚属中大量蝙蝠等野生动物携带的病毒仍笼罩在未知阴影中。目前，全球已测序的冠状病毒中绝大多数未被分离或分子特征化，它们的跨物种传播潜力，尤其是向人类溢出的风险，如同悬在头顶的 “达摩克利斯之剑”，亟待深入研究。病毒进入宿主细胞是跨物种传播的关键步骤，而刺突蛋白（spike）与宿主受体的相互作用又是这一过程的核心。因此，解析 merbecovirus 亚属病毒的受体使用机制，成为评估其人类威胁潜力的关键一环。
为了系统揭开 merbecovirus 亚属病毒的受体奥秘，美国北卡罗来纳大学教堂山分校、加州理工学院等机构的研究人员开展了一系列研究。他们开发了一种名为 “MerbecoType” 的高通量分析方法，基于嵌合刺突蛋白构建假病毒（VSV pseudotype），对整个 merbecovirus 亚属的病毒进入细胞机制进行评估。研究发现，merbecovirus 可根据刺突蛋白受体结合域（RBD）的序列特征分为 4 个进化枝（clade），且受体趋向性呈现枝特异性：包含 MERS-CoV 的 clade 1 使用二肽基肽酶 4（DPP4）作为受体，而多个其他进化枝（如包含 HKU5 蝙蝠冠状病毒的 clade 2）则使用血管紧张素转换酶 2（ACE2）。相关研究成果发表在《Nature Communications》上。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：一是假病毒构建与细胞感染实验，通过将不同病毒的 RBD 替换到 MERS-CoV 刺突蛋白骨架中，制备假病毒并感染表达不同受体的细胞系，检测病毒进入效率；二是冷冻电镜（cryo-EM）技术，用于解析 HKU5 刺突三聚体的三维结构；三是分子克隆与活病毒感染实验，构建具有复制能力的 HKU5 分子克隆，验证其在宿主细胞中的复制能力；四是酶联免疫吸附试验（ELISA），检测 RBD 与受体蛋白的直接结合能力。此外，研究还涉及受体基因克隆、细胞稳定转染、突变分析及系统发育分析等技术。
关键研究结果
功能性受体结合域的定位与受体切换验证
研究人员通过在 MERS-CoV 刺突蛋白中替换不同病毒的 RBD，发现 RBD 边界可通过保守甘氨酸残基确定。以 PDF2180 病毒的 RBD 替换为例，成功实现了 MERS-CoV 刺突蛋白从识别 DPP4 到 ACE2 的受体切换，证明了该嵌合系统的有效性。实验显示，PDF2180 的 RBD 区域（含保守甘氨酸侧翼序列）是受体结合的关键，缩短该区域会导致受体识别能力丧失。
merbecovirus RBD 进化枝分类与受体趋向性
对 GenBank 中筛选的 65 个刺突序列（代表 34 种独特 RBD）进行系统发育分析，将 merbecovirus RBD 分为 4 个进化枝（clade 1-4）。假病毒感染实验表明，clade 1（如 MERS-CoV、HKU4）特异性使用 DPP4；clade 2（HKU5）和 clade 3（如 NeoCoV、PDF2180）使用 ACE2，但 clade 2 表现出严格的宿主特异性，仅日本伏翼蝠（Pipistrellus abramus）的 ACE2 能支持其高效感染，而 clade 3 可识别更广泛物种的 ACE2；clade 4（如 ErinCoV）的受体尚未明确，其在部分人类细胞系中的低水平感染可能依赖外源胰酶。
HKU5 病毒与蝙蝠 ACE2 的特异性相互作用
通过构建 HKU5 全长刺突蛋白假病毒及分子克隆，证实其仅在表达P. abramus ACE2 的细胞中高效复制，而在其他物种 ACE2 细胞中表现微弱。ELISA 实验进一步显示，HKU5 的 RBD 与P. abramus ACE2 存在特异性结合，且突变分析表明，RBD 的 Loop 2 区域对受体结合至关重要，该区域的氨基酸缺失可能限制病毒的进化适应性。
HKU5 刺突三聚体结构特征
冷冻电镜结构显示，HKU5-20s 刺突三聚体的所有 RBD 均处于 “向下” 构象，与其他冠状病毒刺突中常见的 “向上 / 向下” 混合构象不同。这种封闭构象可能与病毒在宿主胃肠道的传播策略相关，低 pH 环境或外源蛋白酶可能触发其构象转换以结合受体。
研究结论与意义
本研究系统揭示了 merbecovirus 亚属的受体使用规律，特别是 HKU5 蝙蝠冠状病毒依赖特定蝙蝠物种 ACE2 的机制，为该类病毒的跨物种传播风险评估提供了关键依据。研究发现，尽管 HKU5 目前对人类 ACE2 的结合能力较低，但其刺突蛋白的结构可塑性（如 Loop 2 区域的突变潜力）可能赋予其适应人类受体的潜力，需警惕其潜在的进化威胁。此外，HKU5 刺突三聚体的独特构象为冠状病毒疫苗设计提供了新靶点，有助于开发针对 merbecovirus 亚属的广谱疫苗。该研究不仅深化了对冠状病毒 - 宿主相互作用的理解，也为 “同一健康”（One Health）框架下的新发传染病防控提供了重要科学支撑。
