核糖体体外催化非标准环状骨架的扩展合成：突破生物聚合物化学空间的新策略

研究人员通过设计26种非经典单体(ncMs)，利用核糖体在体外催化双羧酸酯和肼酯的环化反应，首次实现了5元和6元环状骨架的核糖体介导合成。该研究通过调节取代基优化环化效率，证明RNA核心可独立组装非标准骨架，为生物聚合物合成开辟了新化学空间。

　　

在生物医学领域，如何扩展生物聚合物的结构多样性一直是科学家们面临的重大挑战。核糖体作为自然界最精密的生物合成机器，长期以来被认为只能聚合标准的L-α-氨基酸形成线性多肽。然而，天然存在的许多具有重要生物活性的分子（如青霉素V和戈多孢素）都含有环状骨架结构，这些结构能显著增强分子的蛋白酶抗性、结构刚性和靶标特异性。传统方法需要通过复杂的多步化学反应或酶促修饰来引入这些环状结构，效率低下且难以精确控制。

为突破这一限制，研究人员开展了一项开创性研究。他们设计了两类双功能底物：双羧酸酯和肼酯，每类底物都含有可发生闭环反应的双亲电体和双亲核体。通过利用核糖体的肽基转移酶中心(PTC)的熵捕获机制，研究人员首次实现了在体外直接合成5元和6元环状骨架结构。这一发现不仅拓展了核糖体的催化能力，也为设计新型生物活性分子提供了全新思路。

研究采用了多项关键技术：1）利用柔性酶(Fx)将非经典单体(ncMs)酰化到tRNA上；2）建立无细胞蛋白合成系统(PURExpress^TM)进行核糖体介导的聚合；3）通过质谱分析(MALDI-TOF和LC-TOF)鉴定环化产物；4）设计模拟PTC的RNA类似物验证催化机制。

结果

ncMs-酰化tRNA的合成

研究人员通过柔性酶(Fx)介导的反应，成功将26种设计的ncMs（包括12种双羧酸酯和肼酯）酰化到tRNA上。实验发现，不同底物需要特定的Fx变体(eFx/dFx/aFx)和pH条件(7.5或8.8)才能获得最佳酰化效率。

核糖体介导的环状骨架形成

在无细胞系统中，核糖体能够催化双羧酸酯和肼酯的连续掺入，形成5元吡唑烷二酮和6元四氢哒嗪二酮骨架。其中5元环的形成效率接近100%，而6元环的形成效率受R₁取代基影响显著，当R₁为苯氧基(pKa≈10)时效率可达100%。

环化动力学调控

研究发现，通过系统改变双羧酸酯的R₁取代基（如甲基、乙基、苯基等），可以精确调控环化反应的速率和产率。弱碱性离去基团（如酚盐）能显著提高6元环的形成效率，这与其稳定反应过渡态的能力相关。

PTC类似物的催化活性

研究人员设计了一种70nt的RNA结构(P1c2^UGGU)，模拟核糖体PTC的结构域V。实验证明，仅该RNA结构即可催化环化反应，表明RNA核心具备独立组装非标准骨架的能力。

反应机制解析

通过4-甲基苯甲醛(4-mba)标记实验证实，肼酯的α-氮原子优先攻击P位tRNA的酯键，而β-氮原子随后完成环化。这一发现揭示了核糖体对α-氨基酸的固有偏好性在非标准单体聚合中仍然保持。

结论与意义

这项研究首次证明核糖体能够直接合成多种5元和6元环状骨架结构，突破了生物聚合物合成的化学空间限制。通过理性设计底物结构和优化反应条件，研究人员实现了环化效率从0到100%的精确调控。更重要的是，研究发现RNA核心本身即具备催化这些非标准反应的能力，这为理解生命起源中的原始翻译系统提供了新视角。

该成果发表在《Nature Communications》上，不仅为合成生物学提供了新工具，也为开发新型肽类药物（如增强蛋白酶抗性、提高靶标特异性的环肽）开辟了新途径。未来，通过进一步优化翻译组件（如EF-Tu、tRNAs和核糖体），有望实现更复杂非标准生物聚合物的高效合成，推动生物医药材料的创新发展。