骆驼科抗体片段识别G-四链体结构的分子机制解析及其在非经典DNA结构检测中的应用

研究人员针对G-四链体（G4）抗体识别机制不明确、选择性低等关键问题，通过解析纳米抗体Nb55与凝血酶结合适体（TBA）的晶体结构，首次揭示了抗体利用β-折叠框架（而非互补决定区）特异性识别G4的分子机制。该研究发现Nb55能精确区分不同G4序列，并模拟天然结合蛋白凝血酶的相互作用模式，为开发高特异性G4检测工具提供了结构基础。研究成果发表于《Nucleic Acids Research》，对理解核酸-抗体互作及疾病相关G4研究具有重要意义。

　　

DNA的双螺旋结构早已深入人心，但鲜为人知的是，某些富含鸟嘌呤的序列能折叠成完全不同的G-四链体（G-quadruplex, G4）结构。这种由G-四分体平面堆叠形成的非经典DNA结构，在端粒维持、转录调控等关键生物学过程中扮演重要角色，并与癌症、阿尔茨海默病等疾病密切相关。然而长期以来，G4在活细胞中的存在备受争议，直到G4特异性抗体的出现才提供确凿证据。这些抗体已成为研究G4生物学不可或缺的工具，但令人困惑的是，现有抗体普遍存在选择性低、无法区分不同G4序列的问题，且其分子识别机制始终成谜。

为解决这一难题，卢布尔雅那大学等机构的研究团队在《Nucleic Acids Research》发表了突破性成果。研究人员以经典的凝血酶结合适体（TBA）为模型，首次解析了骆驼科纳米抗体Nb55与G4的复合物晶体结构，发现Nb55通过独特的β-折叠框架（而非传统互补决定区CDR）实现高选择性识别，并惊人地模拟了天然结合蛋白凝血酶的关键相互作用。这一发现不仅揭示了抗体识别G4的分子密码，更为设计精准的G4检测探针开辟了新途径。

研究团队运用多项关键技术：通过噬菌体展示技术从免疫羊驼文库中筛选Nb55；采用X射线晶体学（分辨率1.9 ?）解析游离Nb55及Nb55-TBA复合物结构；利用等温滴定量热法（ITC）测定结合亲和力（K_D=192±7 nM）；结合圆二色谱（CD）和尺寸排阻色谱-多角度光散射（SEC-MALS）分析复合物特性；通过核磁共振（NMR）和定点突变验证关键相互作用界面。

研究结果部分的重要发现包括：

"Nanobody Nb55 binds TBA quadruplex with high affinity"：ITC和CD实验证实Nb55与TBA以1:1化学计量比结合，解离常数达纳摩尔级，并使TBA熔解温度提高8°C，形成稳定的复合物（SEC-MALS测定分子量17.9 kDa）。与常规抗体不同，Nb55结合显著增强CD信号却不改变TBA特征峰位，表明其通过稳定而非重构G4结构实现识别。

"Nanobody Nb55 differentiates TBA from other types of G4 structures"：选择性测试显示Nb55能精确区分15种不同DNA结构，仅结合AGCGA型和TBA型G4（均含对称TT/GGG环和大暴露沟槽），而拒绝结合平行/混合型G4及其他反平行G4（如端粒衍生的篮型/椅型结构）。这种"指纹级"识别能力远超已知的BG4等广谱G4抗体。

"Overall crystal structure of the Nb55-TBA complex"：晶体结构揭示Nb55采用罕见的侧向结合模式，其β-折叠凹面像钳子般卡住TBA的两个TT环。关键发现是：仅界面2（涉及Arg45和Trp105）在溶液中真实存在（突变实验证实），而晶体中观察到的其他两个界面为晶格假象。特别值得注意的是，TBA的T4G突变体完全丧失结合能力，印证了T4在识别中的核心地位。

"Nanobody Nb55 mimics key interactions from the binding interface of thrombin"：结构比对发现Nb55与凝血酶采用惊人相似的识别策略：两者均靶向TT环，且Nb55的Arg45与凝血酶Arg77、Tyr37与Tyr76形成等位相互作用。不同的是，凝血酶利用带正电的exosite I环柔性结合，而Nb55通过疏水β-折叠核心刚性识别，这种结构模拟揭示了自然界趋同进化的精妙。

"The TT loops in TBA form an interaction hotspot"：NMR滴定实验表明，广谱G4抗体SG4也靶向TT环区域（尽管亲和力低10倍），暗示TT环是G4的通用"热点"。这解释了为何不同分子（抗体、凝血酶）能独立进化出对该区域的识别能力。

这项研究从根本上改变了人们对G4-抗体互作的认知：传统观念认为抗体通过CDR环识别抗原，而Nb55却主要利用β-折叠框架的VH-tetrad残基（Tyr37、Gln44、Arg45、Trp47）实现特异性结合。这种"非CDR"策略可能是其高选择性的关键——相比靶向G四分体平面的广谱抗体（如BG4），Nb55通过识别TT环和沟槽结构实现了"结构指纹"识别。

该成果具有多重意义：首先为理性设计G4检测工具提供蓝图，通过改造β-折叠界面可能开发出疾病特异性探针；其次揭示了抗体识别非经典核酸的新范式，对理解自身免疫疾病中抗DNA抗体有启示；最后，Nb55与凝血酶的趋同进化现象，为开发G4靶向药物提供了天然模板。正如作者强调的，虽然广谱抗体适用于某些研究，但针对特定G4拓扑甚至序列的高选择性抗体，将成为探索个体G4功能的关键钥匙。这项研究犹如打开了一扇观察DNA结构多样性的新窗口，让我们得以窥见生命分子更为丰富多彩的存在形式。