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本文综述 CRISPR/Cas 基因编辑技术在临床试验中的应用，聚焦其在遗传疾病（如镰状细胞病、β- 地中海贫血）、癌症、神经系统疾病等领域的进展，分析递送系统、脱靶效应等挑战，展望技术优化方向与未来医学应用潜力。
1. 引言
CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）的发现可追溯至几十年前。20 世纪 80 年代末，研究人员首次在细菌基因组中发现独特的重复 DNA 模式，但直到 2002 年，西班牙微生物学家 Francisco Mojica 才取得突破，提出这些序列是细菌防御系统的一部分，能保护细菌免受噬菌体攻击。后续研究表明，CRISPR 序列充当记忆库，保存过往病毒相互作用的遗传信息，帮助细菌识别和摧毁再次感染的病毒。
基因组编辑是一个快速发展的领域，有望治疗超过 10000 种遗传疾病。此前已有巨核酸酶、锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活样效应核酸酶（TALENs）等方法。2012 年，Jennifer Doudna 和 Emmanuel Charpentier 的突破性发现革新了基因编辑领域，他们发现 Cas9 蛋白可结合 CRISPR 序列并作为分子剪刀切割 DNA，造成双链断裂（DSBs），随后通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）机制实现基因敲除、激活、缺失或插入。CRISPR/Cas9 无需定制 DNA 结合蛋白的专业知识，显著缩短了基因编辑时间并减少了对专业人员的依赖，两位科学家因此获得 2020 年诺贝尔化学奖。
CRISPR/Cas9 系统在工业生物技术、农业和医学等多个领域展现出新机遇。在医学领域，其重点用于治疗传染病、遗传疾病、癌症等。临床前研究已在动物模型、人类胚胎和诱导多能干细胞（iPSCs）中取得有前景的结果，推动了临床试验的开展。2016 年，Lu 及其同事开展了首个 CRISPR/Cas9 系统的临床试验，针对晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者，使用编辑 PD-1 基因的 T 细胞，结果显示 PD-1 表达降低。截至目前，ClinicalTrials.gov 网站上注册的相关临床试验达 69 项，2023 年 12 月，CASGEVY?（Exagamglogene autotemcel）获首次重大批准，用于治疗镰状细胞病（SCD）和输血依赖性 β- 地中海贫血（TDT），FDA 还批准了 LYFGENIA?，但后者因潜在血液恶性肿瘤风险需终身监测。尽管潜力巨大，CRISPR 在临床应用前仍面临技术限制、伦理考量等挑战。
2. CRISPR/Cas9 系统
CRISPR/Cas9 是目前最知名且应用广泛的基因编辑工具，相比 ZFNs 和 TALENs 更简单高效。该系统由向导 RNA（gRNA）和 Cas9 蛋白组成，gRNA 设计为匹配特定 DNA 序列，引导 Cas9 蛋白至基因组精确位置进行基因编辑，Cas9 蛋白则像分子剪刀一样切割 DNA。
原间隔相邻基序（PAM）在 CRISPR 系统中起关键作用，不同 CRISPR 系统有不同 PAM 要求，如化脓链球菌来源的 Cas9 识别 NGG 序列。Cas9 切割 DNA 后激活细胞自然修复机制 HDR 和 NHEJ。Cas9 有多种变体，如 SpCas9（识别 NGG PAM）、SaCas9（体积小，适合递送大小受限的应用）、Cas9 切口酶（nCas9，产生单链切口，降低非预期突变风险）、失活 Cas9（dCas9，结合 DNA 但不切割，用于基因调控）。
除 Cas9 变体外，临床试验还引入碱基编辑和 Prime 编辑等技术以解决传统 DSB 相关限制。碱基编辑利用 nCas9 和脱氨酶，在 gRNA 引导下直接将一个 DNA 碱基转化为另一个，避免 DSB，适用于纠正点突变。Prime 编辑结合 nCas9 和逆转录酶，在引导 RNA（pegRNA）引导下实现插入、缺失和碱基替换等多功能修饰，无需 DSB。
此外，还有 CRISPR/Cas12、Cas12a、Cas13、Cas14 等系统，各有独特组件和操作方法，如 Cas13 是 RNA 引导系统，靶向切割 RNA，适用于调节基因表达和治疗 RNA 病毒疾病。
3. CRISPR/Cas9 在医学中的应用
3.1 遗传疾病
- 镰状细胞病和 β- 地中海贫血：SCD 是常见遗传性单基因血液病，由 11 号染色体 β- 珠蛋白基因第六位谷氨酸被缬氨酸取代引发，导致异常血红蛋白 S（HbS）聚合，红细胞变形寿命缩短，症状包括慢性贫血、疼痛、血管闭塞等，目前仅有约 15% 患者可接受造血干细胞移植（HSCT）。CRISPR/Cas9 有两种主要治疗途径：纠正突变恢复野生型等位基因以增加 HbA 表达；靶向基因调控元件增加胎儿血红蛋白（HbF）生产。临床研究显示，相关治疗显著减少了患者血管闭塞危机和住院率，如 OTQ923 通过破坏 HBG1 和 HBG2 基因启动子诱导 HbF 产生，CTX001 则通过降低 BCL11A 表达重新激活 HbF 并恢复 β- 珠蛋白合成，多项临床试验正在评估其安全性和有效性。
- 遗传性视网膜疾病：包括视网膜色素变性（RP）和莱伯先天性黑朦（LCA）。RP 与 RP1、视紫红质（RHO）、RP GTP 酶调节因子（RPGR）等基因突变相关，CRISPR/Cas9 通过向视网膜下注射 gRNA/Cas9 质粒修复 Rho（S334）基因，改善小鼠视觉能力，ZVS-203e 药物的临床试验正针对 RHO-RP 基因突变进行。LCA10 主要由 CEP290 基因双等位功能丧失突变引起，EDIT-101 的临床试验正在测试单剂量递增治疗携带 LCA10-IVS26 突变的患者。
- 转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTR amyloidosis）：这是一种常染色体显性遗传疾病，由淀粉样纤维在细胞周围堆积导致，威胁心血管和神经系统，进展迅速。NTLA-2001 利用脂质纳米颗粒递送 Cas9 mRNA 和靶向 TTR 的 gRNA，可降低 TTR 蛋白血清水平，且不良反应最小。
- 血友病 A 和 B：分别由凝血因子 VIII 或 IX 基因突变引起，传统治疗面临疗效持续时间短和产生中和抗体的挑战。CRISPR 技术通过纠正突变基因实现稳定治疗，非病毒载体脂质纳米颗粒（LNPs）如 REGV131-LNP1265 作为递送系统，Phase 1 和 2 的预临床研究显示出足够且持续的治疗效果。
3.2 神经系统疾病
CRISPR/Cas9 在神经系统疾病研究中潜力巨大，可用于基因编辑和筛选，涉及杜氏肌营养不良（DMD）、帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病（HD）等。
- 雷特综合征（RTT）：X 连锁显性神经发育障碍，由 Xq28 区域甲基 - CpG 结合蛋白 2（MECP2）基因突变引起，导致突触功能障碍，症状包括小头畸形、社交退缩、癫痫等。CRISPR/Cas9 通过在 iPSCs 中精确插入正确基因序列纠正 MECP2 表达异常，临床前研究显示同源重组（HR）效率达 20-30%，逆转了症状，NCT05740761 临床试验正利用 AAV 递送系统纠正 MECP2 表达。
- 亨廷顿病（HD）：常染色体显性遗传，由亨廷顿基因（HTT）外显子 1 中 36 个或更多 CAG 重复扩增引起，导致行为、运动和认知缺陷。CRISPR/Cas9 在小鼠模型中有效靶向 HTT 基因并降低其表达，为治疗提供了方向，但临床应用仍需进一步研究。
- 杜氏肌营养不良（DMD）：X 连锁隐性遗传，由 X 染色体抗肌萎缩蛋白基因突变导致肌肉结构和功能受损，患者多在 30 岁前死亡，目前无治愈疗法。CRISPR 在动物和人类细胞模型中成功纠正突变，恢复肌肉功能，但需解决安全性、效率和临床前测试等障碍。
3.3 传染病
CRISPR 通过靶向病原体特定基因，破坏其感染和复制能力，为抗微生物治疗和对抗耐药感染提供新途径。早期试验利用 CRISPR 编辑的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）破坏 CCR5 基因（HIV-1 关键病毒受体），治疗 HIV-1 感染，一名同时患有 HIV-1 和严重淋巴细胞白血病的患者成功接受了编辑后的 HSPCs 移植。此外，CRISPR/Cas9-HPV E6/E7 质粒凝胶被用于治疗 HPV 及相关宫颈上皮内瘤变（NCT03057912）。
3.4 癌症
癌症常伴随基因组表观遗传改变，传统化疗存在非特异性靶向和耐药问题。CRISPR 可靶向癌基因突变和肿瘤抑制基因，诱导肿瘤细胞程序性死亡，还可用于 CAR-T 细胞疗法优化和免疫调节。例如，在膀胱癌中靶向 E - 钙粘蛋白和 p21 基因抑制肿瘤生长，在多种癌症中靶向 KRAS、TP53、EGFR、BRCA1/2、APC 等基因。然而，肿瘤异质性导致部分细胞可能对治疗产生抗性，联合疗法（如结合化疗或免疫疗法）正被探索以提高疗效。多项临床试验正在测试 CRISPR/Cas9 在白血病、淋巴瘤、实体瘤等中的应用，如 CTX 系列工程化 T 细胞疗法。
4. CRISPR/Cas9 临床试验的挑战
尽管 CRISPR 相关临床试验数量增长显著，但面临诸多挑战。
- 递送系统挑战：有效将 CRISPR 组件递送至靶细胞或组织是关键。电穿孔法可能损伤细胞和货物；病毒载体（如 AAV、慢病毒）虽高效但存在免疫原性、 cargo 容量有限和生产成本高的问题；非病毒载体（如脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒）免疫原性低、可携带更大 DNA 有效载荷，但效率较低且可能存在细胞毒性。
- 基因组编辑方法选择：针对特定疾病需选择最有效策略，如治疗艾滋病可选择 HDR 创建 CCR5 Δ32 突变或 NHEJ 敲除 CCR5 基因，治疗 β- 地中海贫血和 SCD 可选择 NHEJ 敲除 BCL11A 或 HDR 编辑 HBB 基因，需综合考虑疾病、基因和生物学效应。
- 脱靶效应：由 Cas9、gRNA 和细胞类型等因素引起，可能导致非预期基因突变，可通过递送核糖核蛋白（RNP）、优化 gRNA 设计（如考虑 gRNA 长度、PAM 相邻核苷酸、GC 含量）和 CRISPR 筛选来减少。
- 最佳细胞类型选择：选择合适细胞并确保 CRISPR 有效功能至关重要，如编辑多能或多向干细胞并诱导分化，需考虑转染效率和细胞活力，全基因组测序（WGS 或 WES）可帮助评估脱靶效应。
- 伦理问题：涉及生殖细胞编辑（可能影响后代）、人类胚胎研究的伦理地位和使用，以及疗效、安全性和脱靶效应带来的潜在不可预见后果。
5. 改进 CRISPR/Cas9 系统的解决方案
- 生物信息学应用：帮助分析和预测 CRISPR 系统，通过优化 gRNA 设计（如确定最佳长度、考虑 PAM 相邻核苷酸和 GC 含量）减少脱靶效应。
- CRISPR/Cas9 筛选：通过引入 gRNA 文库筛选脱靶位点，系统评估脱靶效应，优化 gRNA 设计和编辑策略。
- 递送系统进展：非病毒载体递送 Cas9 RNP 具有高效、安全和灵活的特点，可快速实现基因组编辑并减少脱靶和免疫反应；开发体内靶向递送系统（如利用组织特异性启动子和病毒载体组织趋向性）可提高效率和临床实用性。
- 靶细胞类型选择：选择合适靶细胞是基因组编辑的瓶颈，需在癌细胞系验证方法后，在患者干细胞中测试编辑基因表达，同时开发有效且温和的递送技术。
6. 未来展望
CRISPR 在医学领域前景广阔，有望革新遗传疾病治疗。在单基因疾病方面，针对 SCD、β- 地中海贫血、HD 等的临床试验已取得进展，尤其是靶向 BCL11A 基因治疗 SCD，显著提高了 HbF 水平并减少血管并发症。脂质纳米颗粒作为递送系统在血友病治疗中显示潜力，但血友病 B 的编辑效果可能因基因特性不如血友病 A。
在肿瘤学中，CRISPR 可优化 CAR-T 细胞疗法，编辑 T 细胞提高特异性并减少脱靶效应，还可通过多重编辑解决癌症异质性。在传染病领域，CRISPR 可开发抗病毒疗法（如针对 HIV 潜伏库）和快速诊断工具（如 SHERLOCK 和 DETECTR）。
然而，需克服脱靶效应、递送效率和免疫反应等挑战，开发新型递送系统（如 LNP1265）和优化碱基、Prime 编辑技术。随着监管和伦理框架的发展，CRISPR 的临床应用需要严格监督和公众参与，平衡技术潜力与社会伦理影响，尤其是生殖细胞编辑。未来，CRISPR 有望成为精准医学的基石，为多种难治性疾病提供新希望。
