茉莉酸调控的叶际III类几丁质酶ScCHIA通过E-box顺式元件增强霍霍巴冷旱胁迫抗性的分子机制

本研究针对霍霍巴(Simmondsia chinensis)低温敏感性问题，通过叶际蛋白质组学分析发现冷驯化后751种叶际蛋白中200种发生显著变化，鉴定出III类几丁质酶ScCHIA在茉莉酸(MeJA)信号通路调控下通过E-box顺式作用元件增强植物对低温与渗透胁迫的抗性。过表达ScCHIA显著提升拟南芥、酵母和霍霍巴的胁迫耐受性，揭示了叶际在植物非生物胁迫响应中的重要作用，为木本油料作物抗逆育种提供新靶点。

　　

在干旱地区具有重要经济价值的木本油料作物霍霍巴，因其对低温高度敏感性严重限制了在温带地区的种植。当温度降至-5°C时，植株顶芽和花朵易受冻害。虽然冷驯化（Cold acclimation, CA）是提高植物耐寒性的有效手段，但霍霍巴应对低温胁迫的分子机制，特别是叶际（apoplast）这一植物细胞质膜外关键空间在胁迫响应中的作用仍不清楚。

中国的研究团队通过叶际蛋白质组学技术揭示了霍霍巴冷驯化的分子机制。研究采用渗透-离心法提取叶际液，结合TMT标记定量蛋白质组学技术，鉴定出冷驯化后751个叶际蛋白中有200个差异表达蛋白（ApDAPs），主要涉及防御反应、细胞壁修饰、碳水化合物代谢和氧化还原平衡等生物学过程。研究发现III类几丁质酶ScCHIA在冷驯化过程中显著积累，通过酵母异源表达、拟南芥遗传转化和霍霍巴毛状根转化系统证实其能增强多种生物体的低温与渗透胁迫抗性。分子机制解析表明，ScCHIA受茉莉酸甲酯（MeJA）诱导表达，其启动子区的E-box顺式元件通过转录因子ScMYC2介导MeJA信号传导。该成果发表于《Horticultural Plant Journal》，为木本作物抗逆育种提供了新思路。

关键技术包括：（1）优化叶际液提取方法，通过MDH活性检测排除胞质污染；（2）TMT-10Plex标记定量蛋白质组学分析；（3）ScCHIA过表达载体构建及拟南芥、酵母和霍霍巴遗传转化；（4）启动子元件分析结合GUS报告系统、酵母单杂交（Y1H）和电泳迁移率变动分析（EMSA）验证转录调控机制。

【叶际蛋白质组分析】通过比较冷驯化组（15°C/10°C昼夜）与对照组（28°C）的叶际蛋白质组，发现163个上调蛋白和37个下调蛋白。功能聚类显示这些蛋白主要参与氧化还原酶活性（如过氧化物酶）、细胞壁结构蛋白（EXP13、PRP2）和糖代谢（TRE1、BGLU47）。蛋白质互作网络（PPI）分析鉴定出ScCHIA等核心蛋白。

【ScCHIA功能解析】系统发育分析表明ScCHIA属于GH18家族III类几丁质酶。亚细胞定位证实其定位于叶际空间。表达模式分析显示ScCHIA在茎部高表达，且受低温和渗透胁迫显著诱导。在酵母中过表达ScCHIA使细胞在-20°C冷冻和30%山梨醇胁迫下存活率显著提高。

【转基因植物表型】ScCHIA过表达拟南芥在4°C胁迫下初生根长度比野生型（WT）长35%，-4°C冷冻处理后的存活率提高2倍。生理指标检测显示转基因植株积累更多渗透调节物质（脯氨酸含量增加40%，可溶性糖增加25%），MDA含量降低30%，且SOD、POD和APX活性显著增强。气孔孔径测定发现胁迫下转基因植株气孔开度比WT小50%。

【分子调控机制】启动子分析发现ScCHIA含有3个E-box元件。外源MeJA处理使ScCHIA表达量提升4倍。通过构建E-box突变体（P_600-mEbox）证实502 bp处的E-box介导MeJA响应。ScMYC2通过结合该E-box激活ScCHIA表达，Y1H和EMSA实验验证了二者的直接互作。

该研究首次系统揭示了霍霍巴叶际蛋白质组在冷驯化中的动态变化，阐明了ScCHIA通过调节抗氧化系统、渗透平衡和气孔运动增强植物抗逆性的多重机制。发现MeJA-ScMYC2-ScCHIA调控模块为理解植物激素与环境胁迫的信号整合提供了新视角。作为首个在霍霍巴中建立的遗传转化系统（CDB递送系统），为后续基因功能研究奠定了基础。这些发现不仅对拓展霍霍巴种植区域具有应用价值，也为其他木本作物的抗逆育种提供了理论参考。