新鲜泵出母乳中活性细菌群落的动态变化及其冷藏与冷冻保存的影响研究

本研究针对母乳中活性细菌群落在泵出及储存过程中的变化这一关键问题，通过PMA（propidium monoazide）选择性标记结合16S rRNA扩增子测序技术，系统分析了12名健康母亲新鲜泵出母乳在4℃冷藏（24/48 h）和-20℃冷冻（6周）后的菌群变化。结果显示，链球菌（Streptococcus）、葡萄球菌（Staphylococcus）等为母乳优势菌属，冷冻显著降低菌群活性和多样性，而短期冷藏无显著影响。该研究为优化母乳储存实践提供了重要科学依据。

　　

母乳被誉为婴儿最理想的天然食品，不仅提供营养，还通过其独特的微生物组（microbiome）促进婴儿免疫系统发育和肠道菌群定植。然而，随着母乳泵出和储存成为现代哺乳家庭的常态，这些操作对母乳中活性细菌群落的影响却鲜为人知。现有研究多关注总细菌DNA，无法区分活菌与死菌，而只有活菌才可能真正在婴儿肠道中定植并发挥作用。此外，关于冷藏或冷冻储存是否会破坏这些“益生菌”的生态平衡，科学界仍存在争议。

为解决这一关键问题，来自捷克共和国布尔诺的研究团队在《International Breastfeeding Journal》发表了一项创新性研究。他们采用PMA（propidium monoazide，一种选择性标记死菌DNA的染料）结合高通量16S rRNA基因测序技术，首次系统揭示了新鲜泵出母乳中活性细菌群落的真实组成，并对比分析了不同储存条件（4℃冷藏24/48小时 vs -20℃冷冻6周）对这些菌群的影响。

研究方法上，团队从CELSPAC: TNG队列中招募12名健康哺乳期母亲，严格标准化泵奶流程，并设置泵头拭子、无菌水等对照组。通过离心去脂、PMA光活化处理、QIAamp PowerFecal试剂盒提取DNA后，针对16S rRNA基因V4区（~290 bp）进行Illumina双端测序。数据分析采用nf-core/ampliseq流程，经DADA2去噪和Silva数据库注释，最终通过ALDEx2进行组成型差异分析。

研究结果呈现三大发现：

1. 新鲜母乳中的活性菌群特征
通过+PMA（仅活菌）与-PMA（总菌）样本对比，发现活性菌群以链球菌（Streptococcus，相对丰度中位数14.6%）、葡萄球菌（Staphylococcus，12.0%）、透明杆菌（Diaphorobacter，1.9%）和皮肤杆菌（Cutibacterium，1.3%）为主。值得注意的是，PMA处理使测序深度降低67%（p<0.01），证实约三分之二的细菌DNA来自死菌。

2. 储存温度的时间效应
冷藏组（4℃）在48小时内未出现菌群多样性（Shannon指数）或组成的显著变化（p>0.05）。而冷冻组（-20℃）6周后，活性菌的测序深度下降52%（p<0.01），且透明杆菌和皮肤杆菌的CLR（centered log-ratio）转化丰度显著降低（p<0.01），提示冷冻对特定菌属具有选择性杀伤作用。

3. 污染控制的关键发现
通过泵头拭子与阴性对照分析，发现芽孢杆菌（Bacillus）等环境污染物在25%样本中存在，但通过严格的生物信息学过滤，确认93%母乳样本具有区别于污染的独特菌群特征。

讨论部分强调，该研究首次证实母乳中大量细菌DNA实际来自非活性细胞，这对既往基于总DNA的母乳菌群研究提出了方法论反思。更重要的是，短期冷藏可保持菌群稳定的发现，支持了目前临床推荐的“24-48小时冷藏”方案；而冷冻对特定菌属（如皮肤杆菌）的负面影响，则提示长期冷冻母乳可能损失部分功能菌群。

这项研究为母乳库运营和家庭储奶实践提供了直接指导：若需短期储存，冷藏优于冷冻；若必须冷冻，应尽量缩短存储时间以保留活性菌群。未来研究可进一步探索这些储存相关的菌群变化对婴儿健康的实际影响，尤其是皮肤杆菌等具有免疫调节潜力菌属的减少可能产生的临床意义。