CAR-T细胞学术生产的质量控制标准化：UNITC联盟生物生产工作组立场文件

为解决CAR-T细胞学术生产中质量控制(QC)标准不统一的问题，UNITC联盟WP-生物生产工作组开展研究，提出针对支原体检测、内毒素测试、载体拷贝数(VCN)量化和效力评估的标准化方案。该研究通过方法学验证和跨中心实践分析，为医院豁免途径下的CAR-T生产建立了可操作性框架，对提升细胞治疗产品的安全性和可及性具有重要意义。

　　

CAR-T细胞疗法作为肿瘤免疫治疗的突破性技术，其产业化进程却面临高昂成本和复杂物流的制约。欧洲医院豁免条款为学术机构开展CAR-T生产提供了政策空间，但分散化制造带来的质量控制(QC)标准碎片化问题日益凸显——不同中心对支原体检测、内毒素限值、载体拷贝数(VCN)和效力评估的方法学选择差异，可能影响最终产品的安全性和疗效可比性。

法国国家细胞治疗研究联盟(UNITC)WP-生物生产工作组集结24家学术机构专家，通过系统文献分析、多中心调研和德尔菲法共识，制定了适用于医院豁免路径的CAR-T生产QC标准。这项发表在《Bone Marrow Transplantation》的研究，首次为学术中心的分散化生产提供了可操作性技术框架。

研究采用EBMT推荐的共识形成方法论，整合GMP规范、欧洲药典和FDA指南要求，通过两轮研讨会形成技术建议。关键实验技术包括：基于核酸扩增的支原体检测方案对比、重组因子C(rFC)与鲎试剂(LAL)的内毒素检测评估、数字微滴PCR(ddPCR)与定量PCR(qPCR)的VCN量化验证，以及通过干扰素-γ(IFN-γ)ELISA/ELISpot建立标准化效力测试体系。

在支原体检测部分，研究对比了Biofire系统、商业PCR试剂盒和实验室自建方法的性能参数。结果显示商业试剂盒在检测灵敏度(<10 CFU/mL)、符合药典要求和操作便捷性方面具有优势，特别推荐使用经欧洲药典(EP 2.6.7)验证的试剂盒，但强调需进行本地化验证以确认设备兼容性。

内毒素测试方面，研究详细分析了rFC与LAL三种变体(凝胶法、显色法、浊度法)的适用场景。针对CAR-T细胞培养上清可能存在的基质干扰，建议优先选用rFC方法，其通过重组技术避免了鲎血资源依赖，且对复杂生物基质的干扰更小。

VCN量化研究证实ddPCR在绝对定量和检测异质性细胞群方面优于qPCR，但成本较高。工作组提出"阶梯式验证"策略：qPCR用于常规监测，ddPCR用于高风险批次复核，测序技术保留给插入突变风险评估。值得注意的是，学术生产特有的优势在于可使用相同VCN检测方法进行患者长期随访。

效力测试的共识方案聚焦IFN-γ分泌检测，设计四重对照体系：无刺激对照、靶抗原阳性细胞系刺激、靶抗原阴性细胞系刺激(排除同种异体反应)、多克隆刺激阳性对照。研究特别评估了重组蛋白、包被微珠和小鼠细胞系三种刺激源的优缺点，最终推荐使用Jean-Baptiste Latouche团队开发的抗原修饰鼠源细胞系，因其能更好模拟免疫突触形成。

该研究确立了学术机构生产CAR-T细胞的QC最低标准：支原体检测需覆盖药典规定的120种菌株，内毒素限值为5 EU/kg/h，VCN阈值需结合具体载体特性设定，效力测试要求IFN-γ分泌具有抗原特异性。这些标准既满足监管要求，又兼顾了学术中心的技术可行性。

讨论部分指出，标准化QC体系将显著提升"新鲜CAR-T"策略的可行性——避免冷冻保存带来的细胞活性损失，使治疗周期缩短至72小时内。但作者也承认，细胞毒活性检测(如CD107a流式分析)和增殖能力评估等更全面的功能测试，因操作复杂性暂未纳入本次标准。未来将通过自动化检测设备和人工智能(AI)质控系统进一步优化流程。

这项研究的意义在于：首次为医院豁免路径下的CAR-T生产提供可操作的QC标准，促进学术中心与商业生产的质量等效性；建立的IFN-γ效力测试方案已被证明与临床反应相关；提出的阶梯式VCN监测策略平衡了成本与安全性需求。随着半自动封闭式生物反应器的普及，这些标准有望推动CAR-T疗法在罕见病等未满足医疗需求领域的应用拓展。