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为探究肌萎缩侧索硬化（ALS）中 TDP-43 和 FUS 细胞质包涵体（CIs）对 DNA 损伤反应（DDR）的影响，研究人员通过细胞及动物模型发现，CIs 致 ATM 过度激活、DNA 双链断裂（DSBs）积累等缺陷，而 enoxacin 激活 DICER 可恢复 DDR，为 ALS 治疗提供新方向。
在神经退行性疾病的研究领域，肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）一直是备受关注的难题。该病以运动神经元进行性死亡为特征，患者常因呼吸肌麻痹而死亡。目前已知，TDP-43（TAR DNA 结合蛋白 43）和 FUS（融合肉瘤蛋白）在细胞质中形成包涵体（Cytoplasmic Inclusions，CIs）是 ALS 的重要病理标志，同时伴随 DNA 损伤的积累，但这些包涵体如何影响 DNA 损伤反应（DNA Damage Response，DDR）及修复机制尚不明确。解开这一谜团，对于揭示 ALS 的发病机制及开发新的治疗方法至关重要。
为了攻克这一科学难题，意大利国家研究委员会（CNR）下属的分子遗传学研究所 “Luigi Luca Cavalli-Sforza” 等机构的研究人员开展了深入研究。他们聚焦于 TDP-43 和 FUSP525L（FUS 的一种突变形式，P525L 突变）细胞质包涵体与 DDR 之间的相互作用，通过一系列实验揭示了其中的关键机制，并发现了潜在的药物干预手段。该研究成果发表在《Cell Death & Differentiation》杂志上，为 ALS 的治疗带来了新的希望。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：
- 细胞模型构建：在 HeLa 细胞中过表达野生型及突变型 TDP-43 和 FUS，诱导细胞质包涵体形成，并利用免疫荧光（IF）技术观察蛋白定位及 DDR 相关分子（如 γH2AX、53BP1 等）的表达和分布。
- 动物模型研究：使用表达人源 FUS 的转基因小鼠（hFUS 小鼠）作为 ALS 动物模型，通过腹腔注射 enoxacin（一种可增强 DICER 酶活性的小分子化合物），观察药物对 DDR 及 DNA 损伤的影响；同时利用果蝇（Drosophila melanogaster）模型，研究 Dicer-2 过表达对 TDP-43 介导的视网膜 degeneration 的拯救作用。
- 分子生物学技术：通过彗星实验（Comet Assay）检测 DNA 双链断裂（Double-Strand Breaks，DSBs）的形成；运用 RT-qPCR 技术分析损伤诱导长非编码 RNA（dilncRNA）的表达；采用流式细胞分选（FACS）技术富集含 FUSP525L包涵体的细胞，用于后续 RNA 分析。
研究结果
1. TDP-43 和 FUSP525L细胞质包涵体与 DNA 损伤积累相关
在 HeLa 细胞中过表达 TDP-43 或 FUSP525L后，约 30% 和 15-20% 的细胞分别形成细胞质包涵体，且这些包涵体与应激颗粒（Stress Granules，SGs）共定位。未施加外源性 DNA 损伤剂时，含包涵体的细胞已显示出全核 γH2AX 信号增强，彗星实验证实其 DSBs 数量显著增加，表明包涵体的形成足以诱导遗传毒性应激，导致 DNA 断裂。
2. ATM 激酶过度激活是 γH2AX 积累的主要原因
通过抑制 DDR 关键激酶 ATM 和 ATR 发现，ATM 抑制剂（KU60019）几乎完全消除了含包涵体细胞中的 γH2AX 信号，而 ATR 抑制剂（VE-821）仅对 TDP-43 包涵体细胞的 γH2AX 信号有轻微抑制作用。这表明 ATM 是介导包涵体诱导的 DSBs 相关 DDR 激活的主要激酶。此外，含包涵体的细胞在 DNA 损伤后，pATM 焦点形成减少，下游 CHK2 磷酸化水平降低，提示 ATM 激活异常，无法有效传递 DDR 信号。
3. 53BP1 招募缺陷与 DROSHA 水平降低
53BP1 在非同源末端连接（NHEJ）修复途径中起关键作用。含 TDP-43 或 FUSP525L包涵体的细胞在 DNA 损伤后无法形成 53BP1 焦点，且 53BP1 磷酸化水平显著降低。而 MDC1（另一种 DDR 中介蛋白）的焦点形成未受影响，表明包涵体特异性地损害了 53BP1 的招募和激活。进一步研究发现，含包涵体的细胞中 DROSHA（一种参与小 RNA 加工的核糖核酸酶）蛋白水平降低，但 mRNA 水平不变，提示其蛋白稳定性受包涵体影响。
4. 包涵体诱导转录抑制及损伤诱导非编码 RNA 生成缺陷
通过 5 - 乙炔基尿苷（EU）掺入实验发现，含 TDP-43 或 FUSP525L包涵体的细胞新生 RNA 合成显著减少，表明全局转录受到抑制。在 I-HeLa111 细胞中诱导 DSB 后，含 FUSP525L包涵体的细胞无法正常诱导 dilncRNA 表达，而 DROSHA 水平降低可能导致损伤诱导非编码 RNA（如 DDRNAs）生成缺陷，进而影响 DDR 的正常进行。
5. enoxacin 通过增强 DICER 功能恢复 DDR 并减少 DNA 损伤
在细胞模型中，enoxacin 处理可使含 TDP-43 或 FUSP525L包涵体的细胞中 53BP1 焦点增加，γH2AX 水平降低，彗星实验显示 DSBs 恢复至正常水平。在 hFUS 小鼠中，enoxacin 治疗减少了脊髓中的 γH2AX 信号，增加了 53BP1 表达，表明其在体内也能有效激活 DDR，减少 DNA 损伤。在果蝇模型中，过表达 Dicer-2（而非 Dicer-1）可拯救 TDP-43 介导的视网膜 degeneration，提示 DICER 通过生成小干扰 RNA（siRNA）而非微小 RNA（miRNA）发挥作用。
研究结论与讨论
本研究揭示了 TDP-43 和 FUSP525L细胞质包涵体通过诱导 ATM 过度激活、53BP1 招募缺陷、转录抑制及 DROSHA 依赖的非编码 RNA 生成障碍，导致 DDR 功能异常和 DNA 损伤积累，进而促进 ALS 的神经毒性。而 enoxacin 通过增强 DICER 活性，恢复 DDR 功能，减少 DNA 损伤，在细胞和动物模型中均显示出治疗潜力。此外，果蝇实验表明 Dicer-2 介导的 siRNA 途径在神经保护中起关键作用，为 DDR 相关治疗提供了新的机制见解。
这些发现不仅阐明了 ALS 中包涵体诱导遗传毒性应激的分子机制，还确立了 DDR 通路作为治疗 ALS 的重要靶点。enoxacin 作为一种已被研究的小分子化合物，其促进 DICER 功能的特性为开发 ALS 治疗药物提供了有希望的候选方向。未来研究可进一步探索 DICER 激活剂的优化及在更多 ALS 模型中的疗效，为临床转化奠定基础。
