HCV E2糖蛋白与中和/非中和抗体的冷冻电镜结构解析：双价Fab作为基准标记的新策略

为解决丙型肝炎病毒(HCV)疫苗开发中抗体靶向表位的精确识别难题，马里兰大学等团队通过冷冻电镜技术解析了HCV E2糖蛋白与三种抗体（广谱中和抗体HC84.26.5D、中度中和抗体CBH7及非中和抗体CBH4B）的复合物结构（分辨率3.3-3.8 ?）。研究创新性采用双价Fab作为基准标记，克服了小分子复合物成像难题，首次定义了CBH7的新型中和表位，为多表位疫苗设计提供了结构基础。成果发表于《Communications Biology》。

　　

丙型肝炎病毒(HCV)感染全球1-2%人口，每年导致24万人死亡。尽管直接抗病毒药物(DAAs)疗效显著，但高昂费用和持续新发感染凸显疫苗需求。HCV E2糖蛋白是中和抗体的主要靶点，但其表位复杂性及非中和抗体的干扰效应长期制约疫苗开发。传统单克隆抗体Fab片段与E2形成的复合物体积过小（约110 kDa），难以通过冷冻电镜解析，而抗体肘区灵活性进一步增加了结构解析难度。

为突破这一瓶颈，马里兰大学医学院等联合团队通过基因工程构建双价Fab（通过删除V_HSer113或V_HSer112-C_HSer115等肘区残基诱导二聚化），将复合物体积扩大至220-440 kDa，并赋予独特的环形结构特征。研究结合冷冻电镜（Titan Krios显微镜，Gatan K3探测器）、分子动力学模拟和AlphaFold预测，解析了三种抗体-E2复合物结构，关键发现如下：

双价Fab作为冷冻电镜基准标记的通用性验证
双价Fab HC84.26.5D与E2形成440 kDa超复合物（四聚体），局部分辨率达3.8 ?。通过比较单/双价Fab结合实验（生物膜干涉技术验证亲和力无显著差异），证实该方法不干扰抗原结合，为小蛋白结构研究提供新工具。

广谱中和抗体HC84.26.5D的表位特征
该抗体通过V_H1-69基因编码的CDR2疏水尖端（I52-P52a-D53-F54）和短CDR3（10残基）靶向E2前层（front layer）的α1螺旋（Leu441/Phe442）和CD81结合环，表位保守性达82%。不同于其他V_H1-69抗体（如AR3X依赖长CDR3），HC84.26.5D的CDR1/2贡献了68%结合表面积，揭示新的广谱中和机制。

新型中和表位CBH7的发现
CBH7以独特角度横跨E2前/后层（back layer），通过V_HCDR2与β-夹心核心（Tyr507/Pro513/Val515）疏水斑块结合，并诱导AS412表位构象变化阻碍CD81结合。该表位与已知结构（如E1E2复合物）无重叠，被定义为抗原域C的新靶点。分子动力学模拟显示，E2多态性变异（I538V/Q546L/T563V）可增加表位可及性15%。

非中和抗体CBH4B的“免疫逃逸”机制
CBH4B靶向后层保守表位（Arg630/Tyr632），但通过结合E1E2异源二聚体需付出能量代价（亲和力降低40-240倍），提示其可能作为“诱饵”干扰中和抗体功能。AlphaFold预测（置信度0.85-0.91）与实验结构高度吻合，验证了计算方法在抗体-抗原建模中的可靠性。

该研究不仅为HCV疫苗设计提供了CBH7这一新靶点，还建立了双价Fab冷冻电镜分析的通用方法。双价Fab技术可拓展至其他小蛋白体系（如LAG3免疫检查点研究），而AlphaFold与实验结构的互补性为抗体工程提供了高效预测工具。未来研究需进一步探索非中和抗体通过Fc效应功能（如ADCC）在HCV防控中的潜在作用。