罗伊氏乳杆菌DSM 17938浮游与生物膜表型囊泡的生化特性及免疫调节功能研究

本研究针对益生菌Limosilactobacillus reuteri DSM 17938的膜囊泡(MVs)展开系统研究，通过比较浮游态(pMVs)与生物膜态(bMVs)囊泡的毒性、抗癌活性及免疫调节功能，结合核磁共振(NMR)代谢组学和TMT标记定量蛋白质组学技术，首次揭示两种表型囊泡在代谢物浓度和蛋白组分上的差异，证实其通过携带有机酸、氨基酸及免疫调节蛋白（如GroEL、EF-Tu等）发挥潜在抗炎作用，为开发新型后生元制剂提供理论依据。

　　

研究背景与意义
肠道微生物与宿主的互作机制一直是生命科学领域的研究热点。作为全球研究最广泛的益生菌株之一，罗伊氏乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri) DSM 17938已被证实能缓解婴儿肠绞痛、改善成人便秘和儿童腹泻。然而，其发挥健康效益的具体分子机制，尤其是细菌分泌的膜囊泡(Membrane Vesicles, MVs)的作用仍待深入探索。这类直径80-150纳米的脂质双层结构可携带蛋白质、代谢物等活性成分，在细菌-宿主互作中扮演关键角色。但浮游状态(pMVs)与生物膜状态(bMVs)产生的囊泡是否存在功能差异？能否通过调控免疫或代谢途径影响疾病进程？这些问题成为解开益生菌作用机制的重要突破口。

意大利基耶蒂-佩斯卡拉大学药学院联合意大利国家研究委员会等机构的研究团队，在《Scientific Reports》发表了关于L. reuteri DSM 17938两种表型囊泡的系统研究。该工作首次通过多组学联用技术解析了pMVs与bMVs的组成差异，并评估其在癌症治疗和免疫调节中的潜在应用价值。

关键技术方法
研究采用纳米颗粒追踪分析(NTA)和透射电镜(TEM)表征囊泡的物理特性；通过大蜡螟(Galleria mellonella)模型评估体内毒性；利用MTT法和中性红摄取实验检测对胰腺癌(Bx-PC3)、胆管癌(Mz-ChA-1)等细胞系的细胞毒性及RAW 264.7巨噬细胞吞噬功能的影响；结合600 MHz核磁共振(NMR)进行代谢物定量，并采用TMT标记定量蛋白质组学分析蛋白组分差异。

主要研究结果

囊泡的分离与表征
通过超速离心法分离的pMVs平均直径85±4 nm，浓度1.83×10¹¹颗粒/mL；bMVs直径更大(145±2 nm)，但浓度较低(7.87×10¹⁰颗粒/mL)。电镜显示两者均呈现典型球形结构，形态完整。

安全性验证
大蜡螟实验证实，10⁸ MVs/幼虫的剂量下，pMVs和bMVs均未引起死亡或行为异常，而DMSO对照组全部死亡，表明两种囊泡在体内具有良好安全性。

抗癌活性与细胞耐受性
• 短期(24 h)处理中，bMVs对胰腺癌细胞(Bx-PC3)的抑制率(10-20%)高于pMVs(仅最高浓度1×10⁹ MVs/mL有10%抑制)
• 三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-468)对pMVs更敏感，72 h处理出现15%抑制
• 非癌性胆管上皮细胞(H69)在24 h暴露后仅出现<18%的轻微活力下降，72 h后恢复，显示良好生物相容性

免疫调节功能
在脂多糖(LPS)刺激的RAW 264.7巨噬细胞中：
• 预处理24 h的pMVs使中性红摄取恢复至基线90%以上
• bMVs仅在共处理时表现出相似效果
提示pMVs可能通过预防性调节细胞通路抵消LPS损伤

代谢组学特征
NMR鉴定出6种有机酸和9种氨基酸：
• bMVs中乳酸(713 μg/mL)、柠檬酸(80.77 μg/mL)等浓度显著高于pMVs
• 琥珀酸在bMVs中含量达51.99 μg/mL，可能通过调控缺氧诱导因子(HIF-1α)影响炎症

蛋白质组学解析
共鉴定296种蛋白质，其中87种存在表型差异：
• pMVs富含青霉素结合蛋白(PBPs)和糖代谢酶(如果糖透酶)
• bMVs中分子伴侣GroEL/GroES和烯醇酶(enolase)含量更高，这些"兼职蛋白"(moonlighting proteins)可能通过Toll样受体(TLR-2)通路发挥免疫调节作用
STRING分析显示差异蛋白主要参与糖酵解和氨基酸代谢通路

稳定性研究
4周冷藏期间，bMVs的色差(△E=2.13)显著小于pMVs(△E=16.41)，反映其更好的物理稳定性

结论与展望
该研究首次系统比较了L. reuteri DSM 17938两种生理状态囊泡的生物学特性：

1. 安全性：在动物和细胞模型中均显示良好耐受性
2. 功能差异：bMVs携带更高浓度的代谢物(如乳酸、琥珀酸)，可能通过调节肿瘤微环境(TME)酸碱平衡和巨噬细胞极化发挥免疫调节作用
3. 分子机制：EF-Tu、MapA等蛋白的差异表达提示表型特异性互作策略

这些发现为理解益生菌囊泡的跨物种通讯提供了新视角，尤其为开发靶向免疫代谢的"后生元"(postbiotics)制剂奠定基础。未来研究可进一步探索：
• 囊泡尺寸差异对细胞摄取效率的影响
• 关键代谢物(如琥珀酸)在炎症-癌症轴中的剂量效应关系
• 基于GroEL等蛋白的精准免疫调控策略

这项工作通过整合多组学技术和功能实验，为微生物囊泡的转化应用开辟了新路径，相关成果已申请专利保护(数据集编号PXD035326)。