基于DNA-PAINT与光学光子重分配技术的全细胞超分辨成像突破：实现6纳米级分辨率与深层组织观测

研究人员针对单分子定位显微技术(SMLM)在信噪比、穿透深度和视场间的权衡问题，创新性地将DNA-PAINT与光学光子重分配旋转盘共聚焦(SDC-OPR)系统结合。该研究在53×53μm2视场下实现6 nm基底平面分辨率，在果蝇视网膜上皮9μm深度获得亚13 nm定位精度，首次定量揭示胶原蛋白IV分泌囊泡含46±27个分子。这项发表于《Nature Communications》的工作为复杂生物系统中纳米级结构研究提供了通用解决方案。

　　

在生命科学研究中，看清细胞内的纳米级结构犹如用天文望远镜观测遥远星系。传统荧光显微镜受限于光的衍射极限，难以分辨200纳米以下的细节，而电子显微镜虽能提供高分辨率却无法用于活体观测。单分子定位显微技术(SMLM)的出现打破了这一僵局，但现有技术始终面临"三重困境"——高分辨率、大视场和深层成像难以兼得。就像试图同时用望远镜的广角镜头观测星云细节，研究人员不得不在分辨率、穿透深度和观测范围之间做出妥协。

针对这一挑战，来自英国伦敦大学学院、瑞士日内瓦大学等机构的研究团队在《Nature Communications》发表突破性成果。他们巧妙地将DNA-PAINT（基于DNA探针的点积累成像技术）与配备光学光子重分配(OPR)模块的旋转盘共聚焦显微镜(SDC)相结合，开发出SDC-OPR系统。这项技术如同为显微镜装上了"纳米级变焦镜头"，首次在完整细胞和组织中实现了6纳米分辨率，同时保持53×53μm²的大视场和9μm的穿透深度。

研究团队采用三项核心技术：1）设计特定间距的DNA折纸结构作为分辨率标尺；2）利用SDC-OPR系统进行多色Exchange-PAINT成像；3）开发基于序列成像的分辨率增强技术(RESI)。通过果蝇视网膜上皮等生物样本验证，系统性能远超传统TIRF（全内反射荧光）和HILO（高倾斜层状光片）技术。

在DNA折纸验证实验中，SDC-OPR成功分辨间距仅6 nm的DNA对接链，定位精度达1.4 nm（基于克拉美-罗下界计算）。相比之下，传统SDC系统无法分辨10 nm间距的结构。对U2OS细胞核孔复合体(NPC)的成像显示，Nup96蛋白对间距为13±2 nm，与冷冻电镜数据高度一致。

研究团队进一步展示了技术的多功能性：通过Exchange-PAINT同时解析微管、线粒体和NPC三种结构，定位精度保持在3.3-4.0 nm；应用RESI技术将Nup96成像精度提升至3?（埃米级）；在211×211μm²超大视场下仍保持9.5 nm平均精度。3D成像方面，系统无需特殊光学元件即实现线粒体双膜结构解析，膜厚度测量值48±12 nm与理论预期相符。

在生物学应用层面，研究首次在发育中的果蝇视网膜上皮发现E-钙黏蛋白(E-cadherin)在黏着连接(AJ)中的异质性分布。DBSCAN聚类分析显示，AJ中存在230-470 nm的纳米簇，提示不同E-cadherin群体共存。更令人振奋的是，通过定量DNA-PAINT(qPAINT)技术，测得基底膜胶原蛋白IV分泌囊泡平均含有46±27个分子，为细胞外基质组装研究提供了首个单分子水平定量数据。

这项研究的意义不仅在于技术突破，更开创了"大视场-高分辨率-深穿透"三位一体的显微成像新范式。SDC-OPR系统可直接兼容商业显微镜，相比需要复杂光学调校的4PI或调制激发显微技术更易推广。未来结合自淬灭探针等技术，有望实现活体组织的动态纳米观测。正如作者在讨论中指出，该方法将推动从单细胞到组织水平的跨尺度研究，为发育生物学、神经科学和疾病机制研究提供全新工具。特别值得注意的是，该技术对胶原蛋白分泌囊泡的定量能力，或将为纤维化疾病和肿瘤微环境研究开辟新途径。

研究结论部分强调，SDC-OPR系统成功克服了传统SMLM技术的三大限制：1）在53×53μm²视场实现6 nm分辨率；2）在9μm深度保持亚10 nm精度；3）兼容多色成像和定量分析。这些优势使其成为研究复杂生物系统纳米结构的通用平台，从核孔复合体的亚基排布到细胞连接处的分子组织，都能获得前所未有的清晰图像。正如核孔蛋白的埃米级成像所展示的，这项技术已经触及结构生物学的传统领域，有望成为连接荧光显微与冷冻电镜的桥梁。