结核分枝杆菌MmpL5/MmpS5外排泵系统的结构与组装机制解析及其在耐药性中的关键作用

为解决结核病治疗中因MmpL5/MmpS5外排泵介导的临床耐药问题，研究人员通过冷冻电镜技术首次解析了结核分枝杆菌MmpL5/MmpS5-AcpM复合体的高分辨率结构（2.64-3.31?），揭示其独特的肩并肩三聚体组装模式及130?长的胞外"stalk"结构域，并发现意外结合的酰基载体蛋白AcpM。该研究阐明了该系统的药物外排和铁载体转运分子基础，为靶向抑制剂的开发提供了关键结构框架。

　　

结核病作为全球最致命的传染病之一，其治疗正面临日益严峻的多重耐药挑战。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）通过复杂的机制逃避药物杀伤，其中MmpL5/MmpS5外排泵系统因介导一线药物bedaquiline（BDQ）和clofazimine（CFZ）的临床耐药而备受关注。更棘手的是，该系统还负责铁载体（如carboxymycobactin）的转运，对细菌在宿主体内的生存至关重要。然而，由于缺乏高分辨率结构信息，这一关键靶点的分子工作机制长期处于"黑箱"状态。

为破解这一难题，中国科学院上海药物研究所等机构的研究团队采用冷冻电镜技术，首次成功解析了MmpL5/MmpS5-AcpM复合体的精细结构，相关成果发表于《Nature Communications》。研究通过构建MmpS5-MmpL5共表达系统，从耻垢分枝杆菌中纯化天然复合体，结合单颗粒冷冻电镜分析（分辨率2.64-3.31?）和功能验证实验，系统揭示了这一耐药关键元件的组装原理与工作机制。

关键方法学

1. 采用pMV261载体在耻垢分枝杆菌中共表达MmpS5-MmpL5-FLAG融合蛋白
2. 通过抗FLAG亲和层析和分子筛色谱纯化三聚体复合物
3. 利用300kV Titan Krios冷冻电镜采集8961张显微图像，经cryoSPARC软件处理获得四种重构密度图（C1/C3对称性）
4. 结合AlphaFold2预测模型进行原子模型搭建与优化
5. 通过位点突变、BN-PAGE和药物敏感性实验验证功能关键位点

结构与组装特征
在"Structure determination"部分，研究揭示了复合体的三重对称性：三个MmpL5亚基通过独特的"肩并肩"环形排列形成核心，每个MmpS5亚基插入相邻MmpL5之间。最显著的特征是长达130?的胞外stalk结构域，由三个MmpL5的 coiled-coil区域交织而成，这种构象在已知RND（Resistance-Nodulation-Division）转运体中前所未见。意外发现的是，胞质面结合了酰基载体蛋白AcpM（MSMEG_4326），其4'-phosphopantetheine（Ppant）修饰基团插入MmpL5界面。

MmpL5三聚体机制
"The MmpL5 trimer"小节阐明，与典型RND转运体（如AcrB）的"面对面"组装不同，MmpL5通过ECD2结构域和coiled-coil插入区实现三聚化。关键质子传递对Asp²⁷⁶-Tyr⁸⁵⁰/Asp⁸⁴⁹-Tyr²⁷⁷的突变实验证实，Asp²⁷⁶和Asp⁸⁴⁹对BDQ外排功能不可或缺。删除coiled-coil区域导致三聚体解离和功能丧失，证实该区域是维持组装的关键"分子胶水"。

MmpS5的适配器功能
"Interface between MmpL5 and MmpS5"部分显示，MmpS5通过N端跨膜螺旋与MmpL5的TMH8紧密互作，其胞外区域虽未在密度图中解析，但功能实验证明对系统活性至关重要。研究推测MmpS5可能通过形成跨膜裂隙（含PE/CDL脂质分子）作为药物/铁载体的捕获口袋，这一机制不同于AcrB的周质捕获模式。

AcpM的意外角色
"An unexpected binder, AcpM"揭示，AcpM通过静电相互作用和疏水口袋（如Trp⁹⁵²楔入）与MmpL5胞质区稳定结合。序列比对发现结核分枝杆菌铁载体合成蛋白MbtL（Rv1344）具有相似结合界面，暗示AcpM/MbtL可能偶联铁载体生物合成与转运过程。

讨论与意义
该研究首次完整描绘了MmpL5/MmpS5的分子蓝图，其突破性发现包括：1）阐明Cluster I MmpL蛋白通过coiled-coil结构域实现三聚化的新范式；2）揭示MmpS5作为跨膜适配器的精确定位；3）发现AcpM这一新型调控元件。这些发现不仅为理解MmpL家族蛋白的进化多样性提供了结构基础，更重要的是为开发针对该系统的抑制剂开辟了新途径——既可靶向Asp²⁷⁶/Asp⁸⁴⁹质子传递中心，也可干扰coiled-coil三聚化界面或AcpM结合位点。鉴于MmpL5/MmpS5在BDQ临床耐药中的核心地位，该研究对解决结核病治疗困境具有重要转化价值。