YoaA-X解旋酶调控单链DNA结合蛋白动态行为的分子机制及其在DNA损伤修复中的作用

本研究揭示了E. coli解旋酶YoaA-X与单链DNA结合蛋白(SSB)的相互作用机制，通过体外实验和单分子技术证明YoaA-X通过χ亚基介导的物理作用拉动SSB沿DNA转运，首次发现机械酶牵引SSB的分子现象，为DNA损伤修复（如AZT耐受）的分子机制提供了新见解。

　　

在基因组稳定性维持中，XPD/Rad3家族解旋酶扮演着关键角色，而大肠杆菌中的YoaA与DNA聚合酶III亚基χ形成的复合物(YoaA-X)对链终止剂AZT的耐受性至关重要。然而，YoaA-X如何与单链DNA结合蛋白(SSB)协同作用尚不明确。SSB在停滞的复制叉处富集，但其动态调控机制仍是领域内悬而未决的问题。

为解决这一科学问题，Savannah J. Weeks-Pollenz等研究人员在《Nature Communications》发表研究，通过多尺度实验揭示了YoaA-X通过χ亚基"列车车厢式"牵引SSB的独特机制。研究团队首先利用FRET（荧光共振能量转移）技术分析不同DNA底物上YoaA-X的解旋活性，发现SSB对分叉DNA的抑制效应具有结构特异性。结合荧光淬灭实验和电泳迁移率变动分析(EMSA)，证实χ-SSB相互作用是解旋酶结合DNA的前提。通过AlphaFold 3预测的YoaA-X-ssDNA复合物结构显示，χ结合于解旋酶结构域2(HD2)的C端，与SSB结合位点呈背对背排列。最具突破性的单分子实验直接捕捉到SSB被YoaA-X以0.023 μm/s速度定向牵引的现象，而χ突变体(YoaA-X R128A)则丧失此功能。

关键技术包括：FRET实时监测DNA解旋动力学、单分子荧光追踪SSB-AF647运动轨迹、AlphaFold 3结构预测、以及定点突变验证蛋白互作界面。

研究结果部分揭示：

1. SSB对YoaA-X活性的底物特异性影响：FRET显示SSB抑制分叉DNA（如F1底物）解旋达14.1倍，但对5'悬垂DNA(O1)无影响，表明SSB优先结合分叉结构。
2. 3'/5'悬垂长度决定SSB效应：3'悬垂≥7 nt时抑制显著，荧光淬灭实验证实SSB在分叉处结合更紧密。
3. χ-SSB物理互作必要性：χ-R128A或SSBΔC1（缺失F177）突变使解旋活性降至检测限以下，EMSA显示突变体无法与SSB-DNA共结合。
4. YoaA-χ结合模式：IMAC纯化实验证实YoaA的R619/T620残基对χ结合关键，AlphaFold模型显示χ位于解旋酶运动方向后方。
5. 单分子SSB牵引证据：野生型YoaA-X使SSB结合事件频率提升68%，寿命延长至67秒，运动方向与5'→3'解旋方向一致。

结论部分指出，该研究首次阐明了解旋酶通过附属亚基主动牵引SSB的机制，提出"列车-车厢"模型：YoaA-X的χ亚基作为适配器，将SSB锚定在解旋酶后方协同移动。这一发现革新了对SSB动态调控的认知，为理解AZT耐受性中SSB焦点形成的分子基础提供了新视角。研究还暗示，在复制叉遇到损伤时，SSB可能被YoaA-X重新定位以维持单链区域稳定性，这种机制或广泛存在于Rad3家族 helicase中。论文通过整合生物化学、结构生物学和单分子技术，为DNA修复机器的协同工作机制提供了范式。