细胞质DIS3：一种不依赖外泌体的内切核糖核酸酶对环状RNA的降解机制

这篇研究揭示了细胞质DIS3作为独立于外泌体（exosome）的内切核糖核酸酶（endoribonuclease），通过其PIN结构域降解环状RNA（circRNA）的分子机制。研究通过生化分馏和重组蛋白实验证实，DIS3在细胞质中发挥独立功能，并影响多种内源性circRNA的稳定性，为circRNA代谢调控提供了新见解。

　　

Highlights

研究团队通过生化分馏策略，首次鉴定出人源DIS3是一种能够降解circRNA的内切核糖核酸酶。DIS3的PIN结构域在体外实验中展现出对天然circRNA的特异性切割活性。值得注意的是，DIS3在人类细胞中部分定位于细胞质，且其功能不依赖于外泌体核心复合物，表明其作为独立酶发挥作用。

Summary

核糖核酸酶DIS3通常通过PIN结构域与核内外泌体相互作用，并利用其外切核糖核酸酶（exoribonuclease）结构域降解线性RNA底物。然而，其PIN结构域的内切活性及其细胞靶标长期未知。本研究通过生化方法筛选可能降解circRNA的核糖核酸酶，发现DIS3是候选分子。由于缺乏可接近的末端，circRNA能抵抗外切酶降解，因此比线性RNA更稳定。实验证明，DIS3在细胞质中切割多种circRNA，且体外实验中独立于外泌体核心发挥作用。DIS3敲低后，部分circRNA稳定性适度增加，提示细胞质DIS3可能作为独立酶参与circRNA周转。

Graphical Abstract

图示展示了DIS3在细胞质中切割circRNA的模型：DIS3的PIN结构域直接作用于环状底物，而外泌体核心成分未参与该过程。

Introduction

circRNA由前体mRNA剪接生成，广泛存在于包括人类在内的多种生物中。其形成依赖于反向剪接（back-splicing），即5′剪接位点与上游3′剪接位点连接。尽管部分circRNA（如Cdr1as）具有调控功能（如吸附miR-7），但大多数circRNA的降解途径尚不明确。已知RNase L、YTHDF2-RNase P/MRP复合物和G3BP1-UPF1通路可降解特定circRNA，但本研究提出DIS3可能是广泛性降解circRNA的“管家”内切酶。

Results

DIS3与circRNA降解活性共分馏

通过核质分离和硫酸铵沉淀，团队发现细胞质提取物对circRNA（如circNRIP1、circGSE1）具有特异性降解活性。质谱分析鉴定出5种内切酶候选分子，包括已知的G3BP1和DIS3。

DIS3的PIN结构域在体外切割circRNA

酵母和人类重组DIS3实验显示，其PIN结构域突变体（D146N）丧失切割活性，而外切酶结构域突变体（D487N）仍保持活性。分离的PIN结构域足以切割circRNA，且酵母DIS3无需外泌体核心即可发挥作用。

DIS3敲低影响内源性circRNA水平

利用条件性敲除细胞模型，研究发现DIS3缺失导致circSMO等circRNA积累，而线性RNA受影响较小。Northern印迹进一步验证了circRNA的稳定性变化。

细胞质DIS3作为独立酶降解circRNA

免疫荧光和细胞分馏证实DIS3在细胞质中存在。梯度离心和免疫共沉淀表明，细胞质DIS3主要以低分子量形式存在，与外泌体核心结合较弱，而DIS3L1则紧密结合外泌体。

Discussion

研究揭示了DIS3 PIN结构域在circRNA降解中的新功能，并解析了其独立于外泌体的细胞质作用模式。尽管核内DIS3高度磷酸化可能调控其活性，但细胞质DIS3如何选择性靶向circRNA仍需进一步研究。其他内切酶（如ARD1）也可能参与circRNA降解，提示存在多重调控网络。

Limitations

体外实验可能无法完全模拟细胞内环境，且DIS3敲除细胞的残留表达可能影响表型观察。

Resource Availability

所有质谱数据已上传至ProteomeXchange（编号PXD050442），实验材料可通过通讯作者获取。

STAR★Methods

详细描述了细胞模型构建（Flp-In T-REx 293系统）、重组蛋白纯化、RNA降解实验和CRISPR/Cas9基因编辑等技术流程。关键试剂包括针对DIS3、外泌体组分的抗体，以及用于circRNA体外合成的T4 RNA连接酶等。