综述：基于CRISPR/Cas9的DSB修复机制定量研究新方法

《Biochemistry (Moscow)》：Novel CRISPR/Cas9-Based Approaches for Quantitative Study of DSB Repair Mechanics

（编辑推荐）本综述系统探讨了利用CRISPR/Cas9系统研究哺乳动物细胞双链断裂（DSB）修复的最新策略，重点分析了荧光报告基因（如DSB-TRIP、ddXR）在单/多位点DSB监测中的应用，并揭示了Cas9诱导断裂与传统核酸酶的修复机制差异，为DNA损伤修复研究提供了方法论指导。

Abstract

CRISPR/Cas9技术革新了双链断裂（DSB）修复机制的研究范式。与传统核酸酶（如ZFN/TALEN）相比，Cas9通过向导RNA（gRNA）精准靶向的特性，不仅能模拟生理性DSB，还可构建多重断裂模型。荧光报告系统如DR-GFP和EJ5-GFP被广泛用于量化同源重组（HR）与非同源末端连接（NHEJ）效率，而新兴的DSB-TRIP技术通过串联重复序列标记，实现了单细胞水平动态追踪修复过程。

创新性方法学突破

ddXR（dual-digital crossover reporter）系统通过双荧光开关设计，首次实现了对随机基因组位点HR/NHEJ的并行检测。实验数据显示，Cas9诱导的DSB末端结构存在显著微同源（microhomology）倾向，这可能解释其修复偏向NHEJ的现象。值得注意的是，当gRNA靶向转录活跃区域时，修复效率提升2-3倍，提示染色质状态对修复通路选择具有调控作用。

机制比较研究

与电离辐射产生的复杂末端不同，Cas9产生平末端断裂的特性使其更适用于可控修复动力学研究。但需警惕脱靶效应导致的背景噪音，新开发的HiFi-Cas9变体将错误切割率降低至<0.1%。在端粒区域诱导DSB时，观察到ALT（alternative lengthening of telomeres）通路异常激活，这为癌症基因组不稳定性研究提供了新视角。

技术应用前景

将CRISPR筛选与单细胞测序结合，可绘制全基因组修复网络图谱。近期开发的Cas9^D10A切口酶系统，通过产生交错切口模拟生理性损伤，为研究复制叉崩溃相关修复开辟了新途径。这些进展共同推动着DNA损伤响应（DDR）研究从定性描述向定量解析的范式转变。