甲醇趋化受体MtpA与鞭毛蛋白FliC依赖的甲基趋化作用促进PPFM在植物叶际的空间定殖

本研究揭示了粉红色兼性甲基营养菌(PPFM)在植物叶际的空间定殖机制。京都大学团队通过荧光显微技术和基因敲除实验，首次证明甲醇感应趋化受体MtpA依赖的甲基趋化(methylotaxis)和鞭毛蛋白FliC介导的运动性共同促进细菌进入气孔腔，阐明了PPFM在红紫苏植物表面优势定殖的分子基础，为理解植物-微生物互作提供了新视角。

　　

在植物与微生物的共生关系中，叶际(phyllosphere)作为一个独特的微环境，承载着丰富的微生物群落。其中，粉红色兼性甲基营养菌(Pink-pigmented facultative methylotrophs, PPFM)因其能够利用植物释放的甲醇作为碳源，成为叶际中的优势菌群。这类细菌不仅参与植物的生长促进和系统抗性诱导，还与宿主植物形成了互利共生的关系。然而，PPFM如何在植物表面实现空间定殖，以及这一过程背后的分子机制，长期以来都是未解之谜。

京都大学的研究团队以红紫苏(red perilla)及其专性定殖菌Methylobacterium sp. strain OR01为研究对象，开展了一项开创性的工作。研究人员发现，这种细菌能够伴随植物生长发育，从种子传播到整个植株表面，最终定殖于下一代种子。通过先进的荧光显微技术和相关光电子显微镜(Correlative light and electron microscopy, CLEM)观察，研究团队捕捉到了细菌进入气孔(stomata)的动态过程，揭示了甲醇作为化学引诱剂的关键作用。

为阐明定殖机制，研究人员构建了鞭毛蛋白FliC三敲除突变体(ΔfliC-triple-GFP)和甲醇趋化受体MtpA缺失株(ΔmtpA-GFP)。通过流式细胞术(FCM)定量分析和叶面印记(leaf-print assay)技术，发现运动性和甲基趋化(methylotaxis)能力缺陷会显著降低细菌在叶面的定殖效率。特别是，野生型菌株OR01能进入95%以上的开放气孔，而ΔmtpA和ΔfliC-triple突变体分别只能进入52%和几乎无法进入气孔。

研究还发现，与相近物种M. aquaticum strain 22A相比，OR01菌株表现出更强的甲醇趋化能力，这可能是其在红紫苏叶际形成优势定殖的重要原因。通过构建GFP-MtpA融合蛋白，研究人员首次观察到该趋化受体在细胞极形成聚集斑点的现象，提示其可能与其他Che蛋白共同构成趋化感受阵列。

关键技术方法包括：1) 构建GFP/mCherry标记菌株和基因敲除突变体；2) 无菌栽培红紫苏并实施细菌接种；3) 采用流式细胞术定量叶际细菌种群；4) 荧光显微和CLEM技术观察细菌空间分布；5) 毛细管趋化实验测定甲基趋化活性；6) 叶面印记技术分析细菌分布模式。

研究结果部分：
"Colonization of Methylobacterium sp. strain OR01 from seeds to whole plant of red perilla through plant surface"显示，荧光标记的OR01菌株能够从接种的种子传播到整个植株，在新叶和腋芽中定殖密度最高，并成功传播到下一代种子。

"Distribution of Methylobacterium sp. strain OR01 on red perilla leaves"通过叶面印记和显微观察发现，细菌优先定殖于叶缘、叶脉基部、毛状体周围和气孔等特定微环境，CLEM技术捕捉到细菌进入气孔腔的动态过程。

"Colonization and distribution of FliC(flagellin)-deleted mutant of strain OR01 in the phyllosphere of red perilla"表明，鞭毛蛋白缺失导致细菌完全丧失运动能力，在单独接种时定殖量减少至野生型的27.5%，而在竞争性定殖实验中仅剩1.8%。

"MtpA-dependent methylotaxis affected the distribution and colonization of strain OR01 in the phyllosphere of red perilla"揭示，甲醇趋化受体MtpA缺失使细菌进入气孔的能力下降至野生型的17%，叶面定殖量减少约80%。

"The predominant colonization of strain OR01 on red perilla is attributed to its high methylotaxis activity"通过竞争实验证明，OR01菌株的甲基趋化活性是相近物种M. aquaticum strain 22A的50倍，这可能是其在红紫苏叶际形成优势定殖的关键因素。

这项发表在《ISME Communications》的研究具有多重重要意义：首先，首次阐明了甲醇作为挥发性信号分子引导PPFM在叶际空间分布的机制；其次，揭示了趋化运动和甲基感应系统在植物-微生物互作中的关键作用；再者，为理解有益微生物在植物表面的定殖规律提供了新视角。研究发现，植物释放的甲醇不仅能作为PPFM的碳源，还可能作为一种"化学语言"介导宿主与共生菌的交流。这种精妙的互作机制既保证了细菌的能量获取，又可能通过细菌对甲醇的消耗和转化为CO₂，为植物光合作用提供原料，形成互利循环。该研究为开发基于PPFM的植物促生菌剂提供了理论依据，也为探索微生物在农业生态系统中的功能开辟了新思路。