CHO宿主细胞水解酶多重基因敲除技术实现生物制剂中聚山梨酯无痕降解防控

为解决生物制剂中聚山梨酯(PS)被宿主细胞蛋白(HCPs)酶解导致颗粒形成和保质期缩短的问题，Boehringer Ingelheim团队通过CRISPR/Cas9技术对中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中9个PS降解水解酶进行多重基因敲除(KO)，成功构建出具有竞争性抗体滴度和显著降低水解活性的新型宿主细胞系。该研究首次实现>1 Mb基因簇的精准切除，为生物制药领域提供了解决PS降解的通用平台方案，技术成熟度达TRL5级。

　　

在生物制药领域，聚山梨酯(PS20/PS80)作为关键辅料，能稳定蛋白质药物活性成分，防止聚集和表面吸附。然而，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达的水解性宿主细胞蛋白(HCPs)会持续降解PS，释放游离脂肪酸(FFAs)形成颗粒，严重影响药物稳定性和安全性。尽管通过下游纯化可部分去除HCPs，但痕量(<1 ppm)残留仍会导致PS缓慢降解。现有解决方案多为"治标不治本"的临时措施，亟需从源头解决问题的创新方法。

Boehringer Ingelheim制药公司的Linus Wei?、Simon Fischer等研究人员在《TRENDS IN Biotechnology》发表突破性研究，通过多重基因编辑技术构建了新型CHO宿主细胞系。该团队首先利用锌指核酸酶(ZFNs)和CRISPR/Cas9系统，依次敲除9个已确认的PS降解水解酶基因，包括脂蛋白脂肪酶(Lpl)、磷脂酶A2(Pla2g7/Pla2g15)等，并首次成功切除包含31个羧酸酯酶(Ces)基因的两个超大基因簇(>1 Mb)。针对敲除后细胞活力下降问题，进一步敲除促凋亡基因Bax/Bak1，最终获得既能显著降低PS降解活性、又保持高抗体产量的优化细胞系。

研究采用的主要技术包括：1)多轮CRISPR/Cas9基因编辑结合单细胞分选克隆筛选；2)RNA测序验证敲除效率；3)荧光胶束测定(FMA)和4-甲基伞形酮壬酸酯(4-MUN)水解活性检测；4)凋亡信号通路改造；5)14天fed-batch培养评估细胞生长和抗体生产性能。

【Generation of a novel CHO host cell line featuring genomic KOs of nine PS-degrading hydrolases】
通过RNA测序确认9种水解酶在亲本CHO细胞中的表达水平后，研究团队采用"分步敲除+基因簇整体切除"策略。其中Ces1和Ces1f所在的1629 kb基因簇(Ces cluster 1)包含28个基因，Ces2c所在的506 kb基因簇(Ces cluster 2)含22个基因。PCR扩增子测序和缺失PCR证实，所有目标基因均实现双等位基因移码突变或完全切除，且未引起其他水解酶的补偿性上调。

【Multi-hydrolase KO host cell lines are fed-batch process compatible and display substantially reduced PS degradation】
中间型敲除细胞系的fed-batch培养显示，随着敲除基因数量增加，最大活细胞密度(VCD)从25×10⁶ cells/ml降至17×10⁶ cells/ml，收获活力从91%降至20%。但FMA检测表明PS降解率从亲本的70%显著降至多敲除系的<25%，证明水解酶敲除策略的有效性。值得注意的是，LPPLCC中间型细胞(敲除5个基因)表现出异常的葡萄糖消耗增加，提示代谢重编程。

【Apoptosis engineering of multi-hydrolase KO host cell lines by knockout of Bax and Bak1 further improves bioprocess performance】
通过Western blot验证Bax/Bak1双敲除后，细胞收获活力恢复至90%，且VCD曲线平稳。凋亡检测显示，Caspase-3/7活性在多敲除细胞中升高，而BB-KO使该信号降低至亲本水平。这表明早期观察到的活力下降确实源于凋亡通路激活，而非CRISPR脱靶效应。

【Multi-KO host cell lines represent a viable host cell line alternative】
表达IgG1/IgG4的BB-KO生产细胞池展现出显著特征：虽然峰值VCD降低50%，但细胞特异性生产率(q_p)提高2倍，最终抗体滴度达4500-8000 mg/L。蛋白A纯化后，水解活性降低45倍至几乎检测不到水平。产品质量分析显示，除甘露糖化(Man5)略有增加外，高分子量(HMW)物种、电荷变异体等关键参数与亲本系相当。

这项研究标志着生物制药宿主细胞工程的重要突破：首次实现哺乳动物细胞中>1 Mb基因簇的精准删除，创建了首个针对PS降解问题的多基因敲除CHO平台。与下游纯化等传统方法相比，这种"设计即净化"的策略具有根本性优势——无需额外工艺步骤即可消除水解酶污染，特别适用于复杂抗体格式的生产。尽管观察到代谢变化和轻微糖型偏移，但通过凋亡通路改造和克隆筛选可进一步优化。该技术已具备TRL5级成熟度，为行业提供了解决PS降解挑战的通用方案，未来有望成为生物制剂生产的黄金标准。