长期离体培养中工业大麻无性繁殖体系的建立及遗传稳定性评估

本研究针对工业大麻(Cannabis sativa L.)离体繁殖中存在的顶端优势抑制、基因型依赖性及遗传稳定性问题，通过建立基于茎尖切除技术的长期培养体系，结合流式细胞术(FCM-DAPI)和简单重复序列间扩增(ISSR)标记分析，证实该方法可实现高效繁殖(最高增殖系数7.3)且保持基因组稳定性，为种质资源保存和育种提供了新策略。

　　

工业大麻(Cannabis sativa L.)作为兼具经济价值与药用潜力的作物，其纤维、种子油及大麻素在医药、建材等领域应用广泛。然而传统种子繁殖导致的遗传异质性，以及离体培养中普遍存在的顶端优势抑制、基因型依赖性差异和体细胞变异风险，严重制约了优质种质规模化生产。尤其针对低Δ⁹-四氢大麻酚(THC<0.3%)的工业 hemp 品种，现有基于细胞分裂素(如TDZ)的微繁殖方案存在效率低下(增殖系数1-4)、重复性差等问题。更关键的是，长期培养可能引发基因组不稳定，但相关系统性研究仍属空白。

为解决这些瓶颈问题，来自波兰波兹纳天然纤维与药用植物研究所的团队在《Industrial Crops and Products》发表研究，建立了基于茎尖切除技术的长期离体培养体系。通过6年持续追踪3个基因型('Epsilon 68'、'Henola'及杂交种'Carmagnola'×'K 290')的53个株系，结合分子-细胞生物学多维度验证，首次证实物理切除茎尖可突破顶端优势桎梏，同时维持基因组稳定性。

研究采用三大关键技术：1) 茎尖切除诱导侧枝发生技术，通过定时采集14日龄外植体优化繁殖效率；2) 流式细胞术(FCM-DAPI)检测5-75代培养物的倍性稳定性；3) ISSR分子标记分析58代培养物的遗传变异。样本来源于研究所基因库提供的种子建立的无菌株系。

研究结果显示：

1. 离体繁殖体系
   '1565'和'Epsilon 68'基因型表现最佳，单株平均产生4.6-4.8个外植体(含2.5-2.8个茎尖和2个节段)，显著高于'Helola'(2.43个)。特定株系如1565/30和EPS/1增殖系数达7.23和6.90。茎尖外植体生根率(57-100%)显著优于节段(32-58.3%)，且14日龄材料表现出最优生根与生长参数。

2. 遗传稳定性评估
   ISSR分析11-14个引物产生的59-81条扩增带均呈单态性，未发现代际差异。FCM-DAPI证实53-75代培养物的DNA荧光峰位置与对照一致，倍性保持稳定。温室驯化植株存活率达94.8%，且能正常开花结实。

该研究创新性提出：茎尖切除通过打破"生长素-细胞分裂素"平衡的生理机制，规避了传统抗生长素药物的副作用，为细胞分裂素不敏感基因型提供了替代方案。长达6年的追踪首次证实工业hemp离体培养中基因组稳定性，其ISSR标记数据库(UBC807-836等)为种质鉴定建立新标准。研究成果对实现工业化种质标准化生产、保护濒危基因型具有重要实践意义，也为解析顶端优势的分子调控网络提供新视角。

讨论部分强调，相较于TDZ诱导方案，基于现存分生组织的繁殖策略显著降低体细胞变异风险。但作者指出光照条件、培养基成分等仍需按基因型优化，且GBS等高通量测序技术未来可提升变异检测灵敏度。该协议已成功应用于8个hemp品种，为《生物多样性公约》框架下的种质资源保护提供技术支撑。