环境宏转录组学中混合控制实验的定性与定量分析流程优化及标准化研究

为解决环境微生物组研究中低注释率和高异质性导致的定量分析难题，上海交通大学团队通过构建10种微生物的模拟群落（RNA/cell-mixed），系统评估了36种分析流程组合在rRNA去除、分类注释和转录定量等环节的性能，开发出优化流程MT-Enviro（Nextflow实现）。该研究为极端环境微生物组的功能活性研究提供了标准化分析框架，成果发表于《ISME Communications》。

　　

深海、土壤等极端环境中蕴藏着大量未培养微生物，这些微生物在元素循环和生态系统维持中发挥关键作用。传统宏基因组学（metagenomics）仅能揭示功能潜力，而宏转录组学（metatranscriptomics）虽可反映基因表达动态，却面临低注释率、高异质性和缺乏参考基因组等挑战。现有分析工具的性能评估多依赖计算机模拟数据（in silico），难以反映真实实验中的生物学偏差。如何建立可靠的基准数据集和优化分析流程，成为环境微生物组研究的瓶颈问题。

上海交通大学生命科学技术学院的研究团队通过精心设计的混合控制实验，构建了包含10种典型环境微生物（如嗜热古菌Thermococcus eurythermalis A501和深海细菌Shewanella piezotolerans WP3）的模拟群落，涵盖海洋、土壤和极端环境物种。研究采用两种混合策略——细胞混合（cell-mixed）和RNA混合（RNA-mixed），设置4种均匀度梯度，生成24个宏转录组样本（4.17亿条150 bp双端读长）和1个宏基因组样本。通过系统比较36种分析流程组合在质量控制、rRNA去除（使用新建数据库RiBase）、分类注释（Kraken2/MetaPhlAn4/mOTUs3）和转录定量（TPM标准化）等环节的表现，最终开发出优化流程MT-Enviro。

关键技术包括：（1）模拟群落构建：选取10种环境微生物，通过OD₆₀₀控制生长周期，采用改良TRIzol法提取RNA；（2）多维度测序：Illumina HiSeq 2500平台完成宏转录组测序，NovaSeq 6000平台完成宏基因组测序；（3）生物信息学评估：建立映射率、错配率、F1值等12项指标，使用SAMtools、Prodigal等工具进行序列分析；（4）统计学验证：通过Spearman相关性分析、线性回归（如log₂(TPM Ratio)拟合）评估定量准确性。

Defined mock communities enable qualitative and quantitative evaluation
研究证实模拟群落数据质量优异：样本三重复的TPM值相关性达0.928-1（p<2.2e-16），PCA分析显示相同混合方式的样本紧密聚类。宏基因组组装结果与标准基因组（Mock-Ref）比对显示83.9%的覆盖度，证实了参考数据库的可靠性。

Evaluation of RNA acquisition under two mixing modes
RNA混合样本的理论与实际RNA量高度相关（Spearman系数=1），而细胞混合样本因提取效率差异出现显著偏差（Spearman系数=0.972），凸显了RNA混合策略在定量研究中的优势。

Performance of quality control tools
比较Trimmomatic、BBDuk和fastp发现：Trimmomatic在提升基础质量方面最优（完全正常样本比例从28.82%升至45.83%），但BBDuk运行速度最快（较fastp快24倍）。

Enhancing rRNA removal efficiency with RiBase
新建的rRNA数据库RiBase较传统工具SortMeRNA显著提高精确度（均值提升0.198，p=1.49e-06），灵敏度保持0.945的高水平。

Evaluation and optimization of the reference-based alignment pipelines
Trimmomatic+BBMap组合表现最佳，映射率达98.7%。值得注意的是，低丰度物种如Sphingomonas profundi LMO-1在低均匀度样本（III型）中基因检出率<0.9，提示丰度对检测灵敏度的影响。

Evaluation of taxonomic profilers
Kraken2在属水平分类中F1值>0.78，能有效区分近缘种（如Pseudomonas gessardii 5-1与P. veronii 2-3）。而mOTUs3因标记基因数据库缺陷完全漏检Sphingomonas，凸显数据库覆盖度的重要性。

Transcript quantification
以Mock-Ref为基准时，TPM比值与理论值高度吻合（R²>0.9）。使用宏基因组或UniRef90作为参考时，定量结果仍保持显著相关性（R²均值分别为0.766和0.783），但回归系数波动较大（0.533-2.196）。

Real-world performance of MT-Enviro
最终优化的MT-Enviro流程（Trimmomatic+RiBase+BBMap+TPM）在综合排名中胜出，其独特优势在于：（1）整合RiBase提升rRNA去除效率；（2）采用BBMap实现零错配比对；（3）保留Trimmomatic的质量控制精度。

该研究通过创新性的模拟实验设计，首次系统评估了环境宏转录组分析流程的性能边界。MT-Enviro的推出不仅解决了极端环境微生物组研究的定量难题，其开源特性（GitHub可获取）更推动了方法学的标准化进程。值得注意的是，研究中发现的物种特异性RNA提取效率差异（最高达90倍）和标记基因数据库局限性，为未来环境组学研究提供了重要改进方向。随着深海、极地等极端环境探索的深入，这套兼顾准确性与效率的分析框架，将为揭示微生物的环境适应机制和生物地球化学循环功能提供关键技术支持。