蓝藻 Synechocystis sp. PCC 6803 和大肠杆菌中藏红花色素可持续分泌生产研究

藏红花色素（西红花酸、西红花苷）应用潜力大，现有生产需繁琐提取。研究人员在蓝藻中共表达 CCD2 与 SynALDH 实现西红花酸分泌，联合大肠杆菌通过空间分离合成西红花苷，超 95% 色素分泌，简化流程，具工业价值。

　　藏红花作为世界上最昂贵的香料，因其高经济价值被称为 “红色黄金”。其含有的藏红花酸（Crocetin）及其糖基化衍生物藏红花苷（Crocin）不仅是赋予藏红花颜色的关键成分，还具有抗氧化、抗癌、心脏保护、神经保护、抗抑郁和免疫支持等多种药理和促进健康的作用，在食品工业、人类医疗保健和化妆品领域有着巨大的应用潜力。然而，目前藏红花色素的生产策略主要集中在使这些色素在工程细胞中积累并从细胞中分离，这需要大量的生物量收获、提取和回收过程，严重阻碍了这些天然色素的工业生产。为了解决这一难题，来自沙特阿卜杜拉国王科技大学（King Abdullah University of Science and Technology, KAUST）的研究人员开展了相关研究，该研究成果发表在《Plant Communications》上。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：通过代谢工程手段，在蓝藻 Synechocystis sp. PCC 6803 中过表达来自番红花的类胡萝卜素裂解双加氧酶 2（CCD2）和内源性醛脱氢酶（SynALDH）；采用空间分离策略，将蓝藻作为碳固定模块，大肠杆菌作为细胞催化模块；利用超高效液相色谱（UHPLC）、超高效液相色谱 - 高分辨质谱联用（UHPLC-HR-MS）进行类胡萝卜素分析；通过 RNA 测序（RNA-Seq）分析蓝藻对藏红花酸生产的转录反应。

蓝藻中藏红花酸分泌生产菌株的构建与验证

研究人员通过共表达 CCD2 和 SynALDH，首次在蓝藻 Synechocystis sp. PCC 6803 中构建了藏红花酸分泌菌株 CA。在 CA 菌株的培养基中观察到肉眼可见的明显黄色，而对照菌株 ΔNS1 培养基无此颜色。通过 UHPLC 和 HR-MS 分析，检测到与全反式藏红花酸标准品保留时间、UV/Vis 光谱和特征碎片离子匹配的峰（P1），同时发现另一峰（P2），推测为顺式藏红花酸异构体。细胞 pellet 和培养基的比较显示，CA 菌株中超过 95% 的总藏红花酸分泌到细胞外培养基中，仅有少量保留在细胞内。

藏红花酸生产的优化

进一步对蓝藻内源性甲基赤藓糖醇磷酸（MEP）途径进行改造以增加前体供应（命名为 CADI 菌株），并补充葡萄糖，使藏红花酸含量显著增加 10 倍，三天内达到 2.1 mg/L。研究不同葡萄糖浓度对 CADI 菌株藏红花酸产量的影响，发现补充不同量葡萄糖均显著增加产量，50 mM 葡萄糖时产量最高。生产 - 生长相关性分析表明，藏红花酸生产与细胞生长呈正相关，在指数生长期后期保持相对稳定的最大速率，显示出工程菌株用于真正连续生产的高潜力。通过光生物反应器研究不同温度（28℃、30℃和 32℃）和光强（50、100 和 150 μmol/m2/s）对藏红花酸生产的最佳光合条件，发现细胞培养在 28℃和 100 μmol/m2/s 下，5 天内藏红花酸产量最高（约 2.2 mg/L）。

大肠杆菌中藏红花苷的合成

研究人员尝试在产藏红花酸的菌株中引入特征明确的糖基转移酶（UGTs）以完成藏红花苷生产途径，但 UGTs 过表达未成功产生藏红花苷。基于之前有研究在喂食藏红花酸的表达 GjUGT74F8 的大肠杆菌中合成藏红花苷，利用 CA 菌株将藏红花酸大量分泌到培养基中的特性，采用空间分离方法在大肠杆菌中建立下游藏红花苷的生物合成。该策略中，蓝藻 CA 菌株作为碳固定模块持续将二氧化碳同化为藏红花酸，大肠杆菌作为细胞催化模块将藏红花酸转化为藏红花苷。结果成功合成了藏红花苷 III（[M+Na]+：m/z 675.262）和藏红花苷 V（[M+Na]+：m/z 513.210），大部分藏红花酸转化为藏红花苷，6 小时内每升蓝藻培养基产量约 0.25 mg，且大部分藏红花苷释放到培养基中，细胞内仅存少量。葡萄糖供应对藏红花苷生产的影响研究表明，测试范围内（10 mM 至 50 mM）的葡萄糖浓度不是藏红花苷生物合成的限制因素。

藏红花色素的纯化方法

为了从水基生长培养基中提取藏红花酸和藏红花苷，研究人员建立了一种使用 SPE C18-Fast 柱的简单有效方法。测试了不同溶剂对柱中藏红花酸和藏红花苷的洗脱效果，其中甲醇回收效率最高，藏红花酸回收率高达 80%，藏红花苷回收率 75%。使用该方法可在 30 分钟内从工程菌株的细胞外培养基中收集藏红花酸和藏红花苷，生产和纯化模块的整合为藏红花酸和藏红花苷的连续分离提供了太阳能驱动的自动管道原型，避免了生物量收获、提取和回收过程。

蓝藻对藏红花酸生产的转录反应

通过对藏红花酸分泌蓝藻菌株 CA 和对照菌株 ΔNS1 进行 RNA-Seq 分析，发现大多数基因（约 80%）表达水平不变，高达 75% 的差异表达基因倍数变化小于两倍。受影响基因中最大的功能类别是 “假设蛋白”，约占差异表达基因的 40%。藏红花酸生产过程中表达显著升高的基因主要与细胞应激反应相关，包括编码热休克蛋白（HspA 和 HtpG）、GroEL/GroES 分子伴侣和 RNA 聚合酶 σ 因子的基因。相比之下，许多与光合作用相关的基因下调，包括编码光系统 II 亚基（psbA/B/C/D）、铁氧还蛋白（fed2/8）、铁氧还蛋白 - 质体醌氧化还原酶亚基（ndhH/F/D）和类囊体膜蛋白的基因。这些变化表明藏红花酸积累对蓝藻细胞有负面影响，而藏红花酸从细胞分泌到细胞外培养基的机制仍不清楚，进一步研究藏红花酸转运可能对提高产量至关重要。

综上所述，该研究首次报道了使用光合微生物以毫克级分泌生产藏红花酸和藏红花苷。这种方法提供了一种连续高效的生物技术策略，优于传统的 “细胞 - 生物量 - 色素” 路线，为通过绿色自动化过程工业生产藏红花酸和藏红花苷开辟了可能性。值得注意的是，超过 95% 的总藏红花酸和藏红花苷从细胞分泌到细胞外培养基中，为直接从生长培养基中进行简单有效的纯化方法提供了坚实基础，显著简化了整体加工过程。此外，该系统可通过简单更换催化酶轻松扩展到其他相关产品，如 3-OH-β- 环柠檬醛的下游产品苦藏花素和藏红花醛（在工程蓝藻菌株培养基中检测到）。将细菌工厂与中间产物纯化相结合，可为藏红花酸、藏红花苷和其他相关产品的连续绿色生产提供原型，在这些化合物的工业生物技术生产中具有很高的潜力。