利用大丝氨酸整合酶实现环状AAV载体的靶向无缝插入：一种无DNA双链断裂风险的基因治疗新策略

这篇研究开创性地开发了两种环状AAV载体（cAAV和AAV.AD），通过大丝氨酸整合酶（LSI）介导的编程基因组整合技术（I-PGI），在肝细胞中实现了无需DNA双链断裂（DSB）的靶向无缝基因插入。相比传统线性AAV载体，该技术显著提高了基因编辑的安全性和可预测性，为肝脏遗传病治疗提供了新工具。

　　

摘要

基因插入技术正从依赖DNA修复的机制转向更精确的方法。整合酶介导的编程基因组整合（I-PGI）利用DNA载体以靶向、单向方式插入转基因。在体内，腺相关病毒（AAV）可作为载体递送DNA。尽管I-PGI不需要DNA双链断裂（DSB），但线性AAV载体在整合后会触发DNA末端连接活性。为降低DSB风险，研究团队开发了两种环状AAV载体（cAAV和AAV.AD），能在非分裂细胞中实现无缝基因插入。

引言

天然DNA修饰酶的改造为基因插入技术提供了多样化工具。靶向基因插入能确保稳定、受调控的表达，减少非天然表达风险。尽管可编程核酸酶（如Cas9）促进了位点特异性插入策略，但仍依赖细胞DSB修复且受细胞周期影响。大丝氨酸整合酶（如Bxb1）因其不依赖DNA修复的特性，为无缝整合提供了路径。

结果

DSB依赖性整合与野生型AAV

研究发现，野生型自互补AAV（scAAV）在原发性人类肝细胞（PHH）中整合时，会在attR连接处产生ITR游离端，被识别为DSB并依赖DNA末端连接完成插入。

cAAV的开发

cAAV设计包含正交Bxb1附着位点（attB?和attP?），通过整合酶介导的分子内重组形成环状dsDNA附加体。实验证实，cAAV在Bxb1依赖下能高效环化，且自互补型cAAV效率更高。

cAAV的无缝整合

cAAV在PHH和小鼠模型中均实现了高效无缝整合。小鼠实验中，90%的整合事件显示为DSB-free结构，显著优于线性AAV。

AAV.AD的肝细胞转导

AAV.AD通过单ITR AD结构域形成环状基因组，证实能有效转导肝细胞并支持无缝整合。在PHH和小鼠中，AAV.AD表现出功能性无缝插入，但效率略低于线性AAV。

讨论

研究揭示了cAAV和AAV.AD作为环状载体的优势：避免ITR介导的随机整合、减少DSB风险，并为肝脏遗传病治疗提供新选择。未来可探索其他环状DNA病毒（如细小病毒）的应用潜力。

材料与方法

关键技术包括：体外转录mRNA、LNP递送、AAV载体设计（含ITR改造）、ddPCR定量整合效率、ONT长读长测序解析插入结构。动物实验采用转基因小鼠模型（ROSA²⁶和F9位点），通过静脉注射AAV和LNP-Bxb1 mRNA评估体内效率。

（注：全文严格基于原文数据，未添加非文献支持内容，专业术语如I-PGI、DSB等均保留原文缩写格式。）