基于单层离心技术(SLC)筛选的猪精子液态保存期间线粒体生物能量学分析及其对精子质量的影响

本研究针对猪精液17°C保存过程中细菌污染和精子质量下降问题，通过两种密度Porcicoll?胶体(20%和80%)单层离心(SLC)筛选精子，结合Seahorse线粒体能量分析仪、流式细胞术和CASA系统，揭示了精子从氧化磷酸化(OxPhos)向糖酵解的代谢转换规律。研究发现高密度胶体(P80)可筛选高ATP产能精子但长期保存效果不佳，为优化猪精液保存技术和培养基配方提供了重要理论依据。

　　

在养猪业中，人工授精(AI)技术的广泛应用使得精液保存成为关键环节。目前猪精液主要采用17°C液态保存，虽然能维持7天左右的受精能力，但面临两大挑战：一是细菌污染风险，尤其是来自肠杆菌科的革兰氏阴性菌会与精子竞争营养和氧气；二是精子质量随保存时间下降，表现为活力降低和代谢紊乱。更棘手的是，抗生素的过度使用导致耐药性传播，迫使业界寻求物理净化方法。单层离心技术(SLC)因其能同时去除精浆、微生物并筛选优质精子而备受关注，但不同密度胶体对精子能量代谢的长期影响尚不明确。

为解决这些问题，来自意大利国家猪育种协会(ANAS)的研究团队在《Animal Reproduction Science》发表研究，首次系统评估了两种密度Porcicoll?胶体(20% P20和80% P80)对猪精子生物能量学和保存质量的影响。研究采用Agilent Seahorse XFp分析仪实时监测氧气消耗率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)，结合流式细胞术检测线粒体膜电位(JC-1)、活性氧(ROS/MitoSOX Red)和存活率(SYBR-14/PI)，并通过计算机辅助精液分析(CASA)定量运动参数。15头种猪的精液样本被分为对照组(CTR)、P20和P80处理组，在保存第0、3、7天进行分析。

主要技术方法

1. 单层离心筛选：使用密度1.026 g/ml(P20)和1.104 g/ml(P80)的Porcicoll?胶体离心分离精子
2. 生物能量学分析：通过Seahorse XFp系统测定线粒体氧化磷酸化(OxPhos)和糖酵解ATP生成率
3. 精子质量评估：流式细胞术检测线粒体活性(JC-1)、存活率(SYBR-14/PI)和ROS(MitoSOX)
4. 运动能力分析：CASA系统定量9项运动参数如总活力(TM)、前向运动力(PM)等

研究结果

3.1 细胞ATP生成受SLC筛选类型影响
P80处理在D0即显著提升线粒体ATP产量(比CTR高75.8%)，而P20组降低50.4%。至D3时，所有组均转向糖酵解主导(ATP率指数<1)，但P80仍保持较高氧化磷酸化贡献。D7时两组ATP总产量较CTR下降55-69%。

3.2 能量图谱显示代谢状态转变
D0时P80精子呈现典型有氧代谢特征，而P20与CTR处于静息状态。随着保存时间延长，所有样本均退行至静息象限，表明代谢活性全面下降。

3.3 流式细胞术结果

• 线粒体活性：胶体处理显著降低JC-1检测的高膜电位细胞比例，P80组降幅最大
• 细胞存活率：SLC处理使存活率持续下降，D7时P80组仅11.7%存活，显著低于P20(39.1%)
• ROS产生：各组间线粒体超氧化物(O₂^•-)产量无显著差异
• 运动能力：CTR始终保持较高活力，P80在D7时TM降至11.7%，但P20在D7维持较好运动参数如曲线速度(VCL 140.5 μm/s)

讨论与结论
研究发现猪精子在保存期间经历从OxPhos向糖酵解的代谢转换，这与培养基高葡萄糖(131.2 mM)环境有关。虽然P80能筛选出高线粒体活性的精子，但完全去除精浆导致抗氧化保护缺失，加速了精子质量退化。特别值得注意的是，P20组在长期保存中表现相对较好，提示低密度胶体可能更适合临床应用。

该研究首次阐明SLC筛选对猪精子能量代谢的动态影响，揭示胶体密度选择与培养基成分的交互作用。未来研究需优化培养基配方（如添加丙酮酸或调节葡萄糖浓度），并验证筛选精子的实际受精能力。这些发现为开发无抗生素的精液保存技术提供了重要理论基础，对推动养猪业可持续发展具有重要意义。