定向多孔结构锆配位聚合物/壳聚糖复合整体材料用于高效单/多/全局磷酸肽富集

推荐：针对磷酸化肽段富集中单/多位点选择性不足的难题，研究人员通过盐形成反应和双向冷冻策略构建了锆膦酸盐-壳聚糖复合整体材料（ZrPCMs）。该材料无需离心或磁场即可实现单/多磷酸肽差异化富集，通过调控Zr(IV)配位环境与磷酸基团比例，分别实现单磷酸肽（低载量）或多磷酸肽（高载量）的优先捕获，为磷酸化信号通路研究提供了新型分离平台。

　　

蛋白质磷酸化作为最关键的翻译后修饰（PTM）之一，在真核和原核细胞的信号传导中扮演核心角色。异常磷酸化与400余种疾病直接相关，包括癌症、神经退行性疾病等，但磷酸肽的低电离效率和非磷酸肽的信号抑制使得质谱检测面临巨大挑战。传统富集材料如二氧化硅微球、磁性纳米颗粒存在分离繁琐或传质阻力大的缺陷，而整体材料虽具操作优势，却难以区分单磷酸肽（mono-phosphopeptides）和多磷酸肽（multi-phosphopeptides）——这两者在生物学效应上差异显著，例如Bcl2蛋白单磷酸化激活抗凋亡活性而多磷酸化则使其失活。

为解决这一难题，中国科学院研究人员开发了锆膦酸盐-壳聚糖复合整体材料（ZrPCMs）。通过植酸（PhyA）与ZrCl₄反应合成介孔锆配位聚合物（ZrP），再经壳聚糖的氨基与磷酸基团盐形成反应，结合双向冷冻技术构建定向多孔结构。该材料兼具高比表面积（多孔配位聚合物特性）和低传质阻力（整体材料优势），其Zr(IV)分布和磷酸基团比例可精准调控。

关键技术包括：1）双向冷冻法制备定向多孔壳聚糖骨架；2）盐形成反应固定ZrP；3）通过载样量控制实现选择性富集（低载量优先捕获单磷酸肽，高载量倾向多磷酸肽）；4）采用β-酪蛋白酶解液、脱脂牛奶和小鼠肝脏等复杂样本验证性能。

研究结果
材料表征：ZrPCMs呈现层状宏观孔（20-50 μm）和介孔（~10 nm）分级结构，比表面积达135 m²/g，Zr含量为2.8 mmol/g。XPS证实Zr-O-P配位键形成，FTIR显示磷酸基团与壳聚糖氨基的离子交联。

选择性富集机制：

• ZrPCM-1（高磷酸基团）在高载量时因磷酸基团过量抑制单磷酸肽与Zr(IV)螯合，优先富集多磷酸肽；
• ZrPCM-2（平衡配比）实现全局磷酸肽捕获；
• ZrPCM-3（高Zr(IV)）在低载量时因单磷酸肽空间位阻小而选择性富集，而多磷酸肽因局部电荷积累被排斥。

实际样本验证：从1 mg小鼠肝脏中鉴定出1,287个磷酸肽，其中单磷酸肽占比78%（ZrPCM-3）或多磷酸肽占比65%（ZrPCM-1），显著优于商用TiO₂微球。

结论与意义
该研究首次通过材料组成设计实现了磷酸肽位点数的可控富集：ZrPCM-3的单磷酸肽选择性源于低空间位阻的稳定Zr(IV)螯合，而ZrPCM-1的多磷酸肽偏好性归因于磷酸基团的空间屏蔽效应。这种"组成-功能"调控策略突破了传统IMAC材料的非选择性局限，为研究磷酸化位点数依赖性信号调控（如激酶级联反应）提供了关键技术。成果发表于《Carbohydrate Polymers》，为磷酸化蛋白质组学研究开辟了新材料路径。