饮用水样本中嗜肺军团菌检测方法的多中心比较研究：培养法与PCR法的效能评估

这篇多中心研究比较了ISO 11731:2017标准培养法、Legiolert液体培养法（IDEXX）和DI-Check实时PCR法（Diatheva）在817份饮用水样本中检测嗜肺军团菌（L. pneumophila）的效能。结果表明：Legiolert 100 mL/10 mL与培养法一致性高（K值0.785-0.840），且PCR法灵敏度达93%（CFU/L vs GU/L差异需注意）。GVPC培养基显著优于BCYE（P<0.0001），为欧盟指令2020/2184的风险评估提供了可靠替代方案。

　　

ABSTRACT
欧洲指令2020/2184将嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）列为饮用水系统必检病原体。意大利33家实验室对817份水样进行多方法比对：标准涂布培养法（ISO 11731:2017）、Legiolert快速液体培养法（31家实验室）和DI-Check实时PCR法（27家实验室）。结果显示，Legiolert 100 mL与培养法的K一致性达0.785，10 mL版本更敏感；实时PCR灵敏度93%，且实验性简化流程Exp2（免DNA纯化）与标准法高度吻合（K=0.85）。GVPC培养基的嗜肺军团菌检出率显著高于BCYE（P<0.0001），但非嗜肺军团菌仅占12%。

IMPORTANCE
军团病（LD）发病率持续上升，意大利2023年发病率达66.3例/百万人口。本研究验证了液体培养和分子检测作为ISO 11731补充方法的可行性，为欧盟指令实施提供数据支持。

INTRODUCTION
嗜肺军团菌作为机会性管道病原体（OPPP），通过吸入污染水雾引发军团病。欧盟2020年发病率1.9例/10万人，意大利尤为严重。新指令允许采用快速培养（如Legiolert）和分子检测（如实时PCR）辅助标准培养法。但传统培养法存在耗时长（10天）、无法检测阿米巴包裹菌等局限。Legiolert基于酶显色技术，此前研究显示其与培养法等效（US EPA数据特异性96.5%）；而实时PCR可检测死菌与胞内菌，但存在GU/L与CFU/L的量化差异。

RESULTS
Spread-plate culture method
54.6%样本（446/817）阳性，其中嗜肺军团菌占88%。GVPC检出率显著高于BCYE（14.8% vs 4.9%，P<0.0001），但CFU/L计数无差异（P=0.2331）。45份BCYE样本因杂菌干扰无法判读，凸显GVPC的实用性。

Legiolert tests
100 mL Legiolert与培养法比较：灵敏度86.9%（95% CI 84.4-89.4），特异性92.1%。10 mL版本灵敏度更高（vs GVPC时平均相对差异达98%），但异常高值需进一步验证。ISO 17994分析显示Legiolert总体更敏感。

DI-Check实时PCR法
标准法灵敏度93.9%，但特异性仅53.9%（因检测死菌）。Exp2方案（直接裂解过滤膜）表现优异：灵敏度98.8%，与标准法K值0.85，或可减少采样量需求。

DISCUSSION
多中心数据证实Legiolert可作为培养法的替代方案，尤其适合嗜肺军团菌专项检测。实时PCR的高阴性预测值（NPV 86.7%）支持其用于初筛，阳性样本再行培养确认。GVPC培养基的性价比优于BCYE——尽管后者能检出部分非嗜肺军团菌，但其临床意义有限（仅占阳性样本12%）。研究局限性包括各实验室预处理步骤差异，但正因此凸显了方法的普适性。

Conclusions
两种替代方法显著提升检测效率：Legiolert缩短检测周期至7天，Exp2实时PCR方案实现单样本双检。欧盟指令的灵活政策与意大利实验室网络的经验结合，将为军团病防控提供新范式。

MATERIALS AND METHODS
33家实验室（含22家区域参比实验室）按ISO 11731:2017分析1L水样，同步进行Legiolert（100 mL/10 mL）和DI-Check PCR（标准/Exp1/Exp2流程）。统计采用Stata 11.2，ISO 17994评估方法等效性。

（注：全文数据均来自原文，未添加外部信息；专业术语如OPPP、GVPC等保留英文缩写；上标如m³、下标如H₂O按规范呈现）