CpxAR双组分系统通过直接调控T3SS针尖蛋白EseB介导鮰爱德华氏菌生物膜形成的分子机制

这篇研究揭示了鮰爱德华氏菌（Edwardsiella piscicida）中CpxAR双组分系统（TCS）通过负调控其响应调节因子CpxR，进而抑制T3SS（III型分泌系统）针尖蛋白EseB的表达，最终调控生物膜形成的分子机制。研究结合EMSA（电泳迁移率变动分析）、qRT-PCR（定量逆转录PCR）和Phos-Tag SDS-PAGE（磷酸化蛋白检测技术），证实磷酸化CpxR（CpxR–P）与EsrB、EsrC及EseE协同作用于escC–eseE操纵子启动子区域，动态响应环境信号（如吲哚）。该发现为水产病原菌耐药性防控提供了新靶点。

　　

CpxAR双组分系统诱导鮰爱德华氏菌自聚集与生物膜形成
鮰爱德华氏菌作为鱼类肠道病原体，在DMEM培养基中通过T3SS针尖蛋白EseB形成表面丝状附属结构，促进细菌自聚集和生物膜形成。研究发现，缺失组氨酸激酶CpxA（ΔcpxA）显著削弱细菌自聚集能力，晶体紫染色显示其生物膜发育不全，而ΔcpxR菌株表型与野生型（WT）无显著差异。免疫印迹证实ΔcpxA菌株中EseB蛋白水平急剧下降，回补cpxA后表型恢复，表明CpxA是生物膜形成的正向调控因子。

CpxA通过上调EseB促进生物膜形成
ΔcpxA菌株中EseB的转录与分泌水平均显著降低，免疫荧光显示其表面EseB丝状结构缩短且稀疏。通过构建pFPV-escC_{-200 to -1}-gfp报告系统，发现ΔcpxA菌株的GFP信号最弱，qRT-PCR进一步证实escC–eseE操纵子内所有基因（escC、eseB、escA等）的转录均依赖CpxA。

CpxA负调控CpxR，磷酸化CpxR抑制EseB表达
ΔcpxA菌株中cpxR转录水平升高3倍，且CpxR蛋白显著积累。通过构建非磷酸化突变体CpxR_D51A，发现磷酸化CpxR（CpxR–P）可强烈抑制EseB表达，而CpxR_D51A仅轻微影响。Phos-Tag电泳显示，ΔcpxA菌株中CpxR仍可通过AckA-Pta途径磷酸化，暗示细菌存在CpxA非依赖的磷酸化补偿机制。

共转录的cpxR–cpxA操纵子受CpxR直接正调控
RT-PCR证实cpxR与cpxA共转录为单一操纵子，但cpxA亦可独立转录。EMSA实验显示磷酸化CpxR高效结合cpxR启动子（-226至+30区域），而CpxR_D51A结合能力显著减弱。通过阿拉伯糖诱导系统证实，CpxR–P通过正反馈环路增强自身转录，非磷酸化CpxR则作用有限。

EsrAB直接调控CpxAR操纵子
ΔesrB或ΔesrC菌株中cpxR与cpxA转录水平骤降，免疫印迹显示其CpxA-2HA和CpxR蛋白表达减少。EMSA证实EsrB和EsrC可直接结合cpxR启动子，形成TCS级联调控网络，协调T3SS与生物膜形成。

CpxAR与EsrAB协同调控鮰爱德华氏菌生物膜
磷酸化CpxR结合escC启动子（含保守基序GTAACttcagGTAAT）抑制转录，而EsrB（结合基序TTCAGGTaattACCCGAT）、EsrC和游离EseE则正向调控。晶体紫染色显示ΔesrB或ΔesrC几乎完全丧失生物膜形成能力，ΔeseE和ΔcpxA表型中度减弱，表明四者协同精细调控EseB介导的生物膜。

吲哚抑制鮰爱德华氏菌生物膜形成
外源吲哚（0.3–0.5 mM）剂量依赖性抑制生物膜，并降低T3SS蛋白（EseB、EseD等）表达。ΔtnaA（色氨酸酶缺失）菌株中EseB水平轻微上升，但添加吲哚后仍被抑制，提示鮰爱德华氏菌通过非CpxA依赖途径感应吲哚信号。

讨论与展望
研究阐明了CpxAR通过“磷酸化刹车”机制抑制EseB过度表达以维持细菌包膜稳态，而EsrAB-EseE轴则促进T3SS激活。这种双向调控使鮰爱德华氏菌能动态响应宿主肠道环境（如微生物群衍生的吲哚）和营养压力（DMEM模拟的体内限铁条件）。未来研究可聚焦PhoQP或EsrAB是否参与吲哚感应，以及靶向CpxAR-escC–eseE通路的新型抗菌策略开发。