高分辨率熔解曲线分析技术在布基纳法索和肯尼亚SARS-CoV-2变异株监测中的应用及流行病学意义

这篇研究推荐了一种基于高分辨率熔解曲线分析（HRM）的低成本、高通量SARS-CoV-2变异株监测方法，适用于资源有限地区。通过开发HRM-VOC-1和HRM-VOC-2两种多重检测体系，研究团队在布基纳法索和肯尼亚的205例样本中实现了对Alpha、Delta和Omicron BA.1变异株的精准识别（灵敏度92.86%-100%，特异性99.29%-100%），与纳米孔测序（NGS）结果高度一致。该技术将单样本检测成本降至<$1，为弥补中低收入国家（LMICs）基因组监测缺口提供了可行方案。

　　

ABSTRACT

SARS-CoV-2变异株的快速进化凸显了可及性监测工具的迫切需求。尽管全基因组测序（WGS）是金标准，但其高昂成本限制了中低收入国家（LMICs）的应用。本研究开发了两套高分辨率熔解曲线（HRM）检测体系——HRM-VOC-1和HRM-VOC-2，通过靶向刺突蛋白（Spike）和核衣壳蛋白（Nucleocapsid）的关键突变位点（如S_del.156-157、N_D3L、S_EPE等），实现了对Alpha、Delta和Omicron BA.1变异株的单管多重检测。基于MALCOV研究在布基纳法索和肯尼亚采集的205份样本验证显示，HRM-VOC-2对Omicron BA.1的检测灵敏度达100%，特异性99.38%，且成功扩展应用于506例样本的筛查，清晰描绘了变异株更替动态。

INTRODUCTION

COVID-19大流行期间，SARS-CoV-2变异株（VOCs）的涌现对全球公共卫生构成持续威胁。尽管非洲国家通过国际合作提升了测序能力，但截至2021年9月，非洲贡献的基因组数据仅占全球1%。HRM技术凭借其检测单核苷酸多态性（SNPs）的灵敏度，成为填补监测空白的潜在方案。本研究在前期工作基础上，优化设计了可同时识别Alpha（靶向S_A570D）、Delta（靶向S_L452R）和Omicron BA.1（靶向S_EPE缺失）的HRM-VOC-2体系，并纳入Orf1b基因作为内参控制。

MATERIALS AND METHODS

样本与实验设计
研究纳入MALCOV项目（NCT04695197）2021年2月至2022年2月采集的鼻咽拭子样本，使用QIAamp Viral RNA Kit提取RNA。HRM反应采用Lunar Universal Probe One-Step RT-qPCR试剂盒，在QuantStudio 5/6/7平台运行。测序参照Artic vV.4.1引物方案，通过纳米孔MinION完成。

生物信息学分析
使用NextClade（v2.14.1）进行变异株分型，通过MedCalc计算诊断效能指标。Cohen's kappa评估HRM与NGS的一致性，McNemar检验比较两种HRM体系的性能差异。

RESULTS

变异株流行动态
肯尼亚样本中，测序鉴定出20I（Alpha）、21A/21J（Delta）和21K（Omicron BA.1）等谱系。HRM-VOC-2在506例筛查中成功识别78.3%的样本，明确显示Alpha（2021年3-5月）→Delta（2021年6-11月）→Omicron BA.1（2021年12月起）的更替趋势，与非洲其他国家报道一致。

检测性能
HRM-VOC-2对Delta的灵敏度（92.31%）略优于HRM-VOC-1（90.08%），两者对Omicron BA.1的灵敏度均>93%。所有无效结果均来自Ct>30的样本，提示应优先检测高病毒载量样本。

DISCUSSION

HRM技术以<1/样本的成本优势（对比NGS的 12/样本），为资源有限地区提供了可行的分子流行病学工具。其局限性在于依赖已知突变谱，但异常熔解曲线可提示潜在新变异，指导靶向测序。未来可通过机器学习优化峰值判读，并扩展至其他病原体（如疟原虫耐药基因）监测。

Conclusion

HRM-VOC体系实现了SARS-CoV-2变异株的快速、低成本筛查，尤其适用于测序基础设施薄弱地区。该技术框架可灵活适配新发变异株，为全球传染病监测网络提供了重要补充。