化学蛋白质组学揭示鼠伤寒沙门氏菌中2-氨基丙烯酸应激的全局性影响及其PLP依赖性酶损伤机制

这篇研究通过化学蛋白质组学技术结合吡哆醛（PL）探针，系统解析了鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica）中2-氨基丙烯酸（2AA）应激对吡哆醛磷酸（PLP）依赖性酶的全局损伤机制。研究揭示了2AA通过攻击PLP辅因子形成不可逆加合物（2AA-PLP adduct），导致关键代谢酶失活，并首次建立了一种基于点击化学的蛋白质组学流程，为理解细菌代谢应激和维生素B6稳态调控提供了新视角。

　　

化学蛋白质组学技术解析2AA应激的分子机制

ABSTRACT
吡哆醛5′-磷酸（PLP）是中心代谢中多种酶反应的关键辅因子。2-氨基丙烯酸（2AA）作为PLP介导反应的催化中间体，在缺乏去氨酶RidA的鼠伤寒沙门氏菌中积累，引发细胞应激。2AA通过攻击PLP依赖性酶（PLP-DEs）活性位点，形成共价加合物导致酶失活。本研究开发了一种基于PL探针的化学蛋白质组学流程，结合点击化学技术，首次在全局水平上揭示了2AA对沙门氏菌蛋白组的损伤谱，并鉴定了新的2AA靶点酶。

INTRODUCTION
微生物代谢网络的调控依赖于复杂的翻译后修饰和应激响应。2AA应激范式源于RidA蛋白缺失导致的2AA积累，其通过与PLP-DEs的PLP辅因子反应，生成稳定的2AA-PLP加合物，已证实可抑制IlvE、GlyA等酶的活性。传统单酶研究难以全面评估2AA的全局影响，而化学蛋白质组学技术通过PL探针（如PL1、PL2）标记PLP-DEs，为系统性研究提供了新工具。

RESULTS AND DISCUSSION

生长分析揭示PL探针标记的实验设计
通过比较pdxJ（PLP合成缺陷）和pdxJ ridA（2AA积累）突变株的生长表型，发现PL1可作为唯一维生素B₆来源支持细菌生长，而PL2仅能通过辅因子交换标记。添加异亮氨酸（Ile）抑制IlvA活性后，PL1的 salvage效率显著恢复，证实2AA应激影响PLP代谢通路。

PLP-DEs的富集与2AA损伤标志
采用两种工作流程：

1. 还原流程（NaBH₄处理）：共富集25个PLP-DEs，包括已知靶点Alr、IscS和IlvA，覆盖沙门氏菌38%的预测PLP-DEs。
2. 非还原流程：特异性捕获与PLP稳定结合的蛋白，如PLP稳态调控蛋白PdxK和转录抑制因子PtsJ，其PLP结合位点通过晶体结构已证实。

2AA应激的全局蛋白组特征
在高2AA条件下（添加Ser抑制Ile），12个蛋白质显著富集，包括：

• 经典靶点：IscS（半胱氨酸脱硫酶，log₂富集比最高）、DadX（丙氨酸消旋酶）。
• 新发现靶点：PdxH（PNP氧化酶）和GlgP（糖原磷酸化酶），后者利用PLP磷酸基团而非典型醛胺键催化。
• 意外靶点：IlvA自身被2AA攻击，提示其活性位点可能暴露于胞内游离2AA。

结论与生理意义
该研究建立了首个2AA应激的全局蛋白质组图谱，揭示了PLP-DEs的损伤广度，并发现2AA通过干扰PLP salvage通路（如PdxK抑制）加剧代谢紊乱。PL1探针在生长培养基中的差异化标记效率，为维生素B₆稳态研究提供了新思路。未来可扩展此技术至其他病原体，探索2AA应激与抗生素耐受性的关联。

MATERIALS AND METHODS
实验采用沙门氏菌LT2衍生株，通过LC-MS/MS（DDA/DIA模式）分析PL探针标记的蛋白质组。数据经MaxQuant和DIA-NN处理，以Student’s t检验（P<0.05）筛选显著靶点。

ACKNOWLEDGMENTS
研究受Merck Future Insight Prize和NIH（RO1GM095837/R35GM153189）资助，凸显其在代谢应激和抗菌策略领域的潜在应用价值。