人类前导链DNA聚合酶ε全酶的校对机制：冷冻电镜揭示PCNA约束下的6碱基对解旋与错配编辑新范式

这篇突破性研究通过冷冻电镜（Cryo-EM）首次捕获了人类DNA聚合酶ε（Polε）与增殖细胞核抗原（PCNA）全酶复合物在生理条件下的三种校对中间态。研究发现PCNA的立体约束迫使Polε解旋6个碱基对（远超既往报告的3bp），形成独特的"错位碱基配对"结构，揭示了滑动钳（sliding clamp）在维持复制保真度中的核心作用，为癌症相关POLE1突变导致的C-to-G颠换（transversion）提供了分子解释。

　　

Significance
真核生物前导链DNA聚合酶ε（Polε）作为双功能酶，其校对机制对维持基因组稳定性至关重要。这项研究首次在生理相关条件下——即Polε与增殖细胞核抗原（PCNA）形成全酶复合物，并通过原位生成错配（而非预存错配）——解析了完整的校对过程。研究突破性地发现PCNA的立体约束会显著改变Polε的校对路径，导致6个碱基对的异常解旋和错位重配对，这一发现挑战了既往基于非全酶体系建立的校对模型。

Abstract
Polε的校对活性依赖其3′-5′外切酶（exo）位点与DNA合成（pol）位点间40 ?的精确协作。本研究通过冷冻电镜捕获了Polε-PCNA全酶复合物的三种真实校对中间态：错配锁定态、聚合酶回溯态和错配编辑态。关键发现包括：1）预存错配的模板/引物（T/P）无法进入全酶的exo位点；2）原位生成的错配引发6 bp解旋（而非经典模型的3 bp）；3）解旋区域形成非常规的错位碱基配对；4）PCNA通过空间约束重塑DNA轨迹。这些发现为理解癌症相关POLE突变导致的C-to-G颠换提供了结构基础。

Results
Polε全酶无法处理预存错配
使用35 bp双链DNA的设计发现，预存G•T错配的T/P被阻滞在Polε的主底物通道中，无法到达exo位点。冷冻电镜结构显示PCNA的环形约束使DNA末端突出6 bp，而exo结构域的拇指接触环（TCL）形成空间位阻。

原位错配触发真实校对过程
通过设计特殊模板序列（含连续T延伸）并仅提供dTTP，成功诱导Polε在pol位点原位合成错配。捕获的三种中间态显示：1）错配锁定态中聚合酶前移1 bp使手指结构域（fingers）开放；2）回溯态出现初始解旋；3）编辑态完全解旋6 bp并形成4个错位配对。

独特的6 bp解旋机制
在编辑态中，解旋的引物与模板形成P-2:dT/T0:dT等非常规配对。这种异常构象源于Polε特有的短β发夹（相比其他B家族聚合酶），使其无法有效分隔解旋链。同时，exo结构域的Phe-285通过π-π堆叠稳定错配末端，解释了癌症常见突变P286K/R的功能影响。

PCNA驱动的构象重排
比较三个中间态发现：1）P结构域12°倾斜驱动DNA螺旋上升；2）连接螺旋（linker helix）36°旋转使拇指结构域移位7.9 ?；3）锚定环（Arg-975）从DNA小沟解离促进解旋。这些变化共同导致DNA相对于PCNA发生10°倾斜。

Discussion
本研究确立了PCNA在全酶校对中的核心作用：1）维持Polε的三点结合（P结构域-PCNA1、拇指-PCNA2、PIP-PCNA3）；2）强制6 bp解旋（而非游离Polε的3 bp）；3）通过空间限制引导DNA轨迹。特别值得注意的是，解旋区域的错位重配对可能解释复制滑动（replication slippage）现象——这在串联重复序列区域尤为显著。

Materials and Methods
使用全长人源Polε（含POLE1-4亚基）和PCNA三聚体，分别通过预存错配DNA和原位错配生成系统制备样品。冷冻电镜数据收集在300 kV Titan Krios显微镜完成，最终重构分辨率达3.11-3.88 ?。结构建模采用Coot， refinement使用PHENIX。

这项研究不仅为理解真核生物前导链复制的保真机制树立了新标准，更揭示了PCNA作为"分子轨道"引导校对过程的精确性。发现的6 bp解旋特征和非常规碱基配对模式，为开发针对POLE突变肿瘤的精准干预策略提供了全新靶点。