嗜热厌氧菌核糖-5-磷酸异构酶B的突变与结构分析：底物结合口袋构象与转化效率的关联机制

本研究针对嗜热厌氧菌AtRpiB酶在D-阿洛糖合成中稳定性差、转化效率低的问题，通过多维突变设计构建82个单突变体和27个双突变体，发现S39V/R109F突变体在80°C下活性提升1.9倍，D-阿洛糖转化率达38.21 g/L（18小时），创RpiB类酶最高纪录。分子动力学模拟揭示Loop 3/9/10构象调整是影响催化效率的关键，为非金属依赖型异构酶的工业应用提供新策略。

　　

在功能性糖类研究领域，D-阿洛糖(D-allose)因其独特的生理功能备受关注。这种C-3位差向异构体的稀有糖，甜度达蔗糖80%却热量极低，更展现出抗癌、降压、抗氧化等多重功效。然而自然界中D-阿洛糖含量稀少，化学合成法存在污染大、成本高的问题，生物酶法催化成为更环保的选择。其中核糖-5-磷酸异构酶(Ribose 5-phosphate isomerase, RPI)因其非金属依赖特性，相比需要金属辅因子的L-鼠李糖异构酶更具应用优势。但现有RPI尤其是来自嗜热厌氧菌Acetivibrio thermocellus的AtRpiB，存在热稳定性差、催化效率低的瓶颈，严重制约工业化生产。

针对这一难题，研究人员开展了AtRpiB的深度改造工程。通过系统分析酶学特性，发现野生型AtRpiB最适温度为50°C、pH 7.5，但在60°C以上稳定性急剧下降。研究团队创新性地采用"分子对接-丙氨酸扫描-分子动力学(MD)模拟"三联策略，锁定底物结合口袋中10个关键氨基酸，构建包含82个单突变体的文库。筛选发现9个单突变体显著提升D-阿洛糖转化率，进而组合构建27个双突变体。

关键技术包括：基因合成与大肠杆菌表达系统、定点饱和突变技术、高效液相色谱(HPLC)检测转化率、圆二色谱分析热稳定性、分子对接(AutoDock Vina)预测结合能、以及全原子分子动力学模拟(AMBER软件)追踪构象变化。

异源表达与酶学特性
SDS-PAGE证实17 kDa的AtRpiB在E. coli中成功表达。酶活分析显示野生型在50°C维持3小时仅剩60%活性，而突变体R109W/R132Q在40°C活性提升1.39倍，S39I/R109F在60°C提升1.58倍。

突变体性能突破
明星突变体S39V/R109F展现出卓越性能：80°C下活性较野生型提高1.9倍，40°C反应18小时可将100 g/L D-阿洛糖前体D-果糖(D-psicose)转化为38.21 g/L D-阿洛糖，创下RpiB类酶的最高转化纪录。

构效关系解析
MD模拟揭示S39V/R109F突变通过重塑Loop 3/9/10的构象动力学：

1. 第3环区(R33-R41)刚性增强，减少底物逃逸
2. 第9环区(T105-R112)形成新的π-π堆叠，稳定过渡态
3. 第10环区(D128-E136)构象变化加速产物释放

这项研究不仅实现了AtRpiB催化效率的突破，更通过结构-功能分析建立了"底物通道构象可调性"的新理论模型。突变体在高温下的卓越表现，使其在食品工业高温加工场景中具有独特优势。非金属依赖特性避免了金属离子污染，符合清洁生产要求。Yingshuai Wu、Han Zhao等作者在《Enzyme and Microbial Technology》发表的成果，为稀有糖生物制造提供了新工具，其揭示的构象调控机制对其它异构酶的改造具有普适指导意义。